从质谱数据定多肽蛋白质.ppt

第四讲从质谱数据鉴定多肽/蛋白质 开场白 在之前的讲座中，我们已经学到了关于蛋白质组学中的重要工具—质谱仪的知识。 蛋白质组学里，质谱仪的作用是鉴定混合物中的蛋白质。然而，没有数据分析的辅助，它是做不到这一点的。 讲座大纲 本讲座中，将分别讲述两种鉴定蛋白质的方法。其一是质量纹鉴定法（Peptide Mass Fingerprinting），另外一种是二级质谱的数据库有哪些信誉好的足球投注网站鉴定法（MS/MS Database Searching）。 我们将简略的介绍质量纹鉴定法。而用更多的时间讨论用于二级质谱上的方法。 多肽质量纹鉴定 多肽质量纹（Peptide Mass Fingerprinting，PMF）是从一级质谱（MS）中鉴定多肽的主要方法。 多肽质量纹一般都是在MALDI-TOF仪器的结果上进行。 其原理就是利用了蛋白序列数据库中的多肽质量的信息。 我们下面的讨论，先假设一张质谱图对应一个蛋白。后面会讨论处理多个蛋白的情况。 一级质谱图 蛋白质经过酶解后，送入质谱仪，得到一级质谱。 目前来说，由MALDI-TOF质谱仪产生的质谱图精度较高，而由ESI质谱仪产生的质谱图精度相对较低。 另一个问题是，ESI产生的质谱图中的离子通常带有很多电荷，而MALDI质谱图中的离子一般只带一个电荷，比较容易计算。 所以从一级质谱鉴定蛋白质的算法（质量纹）主要用在MALDI-TOF产生的质谱图上。 Sample MS Spectrum 蛋白序列数据库 在美国国家生物信息中心的网站上可以查询到必威体育精装版的蛋白序列数据库。 NCBI上的数据库中，信息最丰富的是Genpept格式，包括有蛋白的序列，各种性质，甚至于参考文献。 但是对我们来说，我们只需要蛋白序列的信息就够了。 Genpept示例 FASTA格式 FASTA格式就是蛋白的氨基酸序列。 虚拟酶解 对应于送进质谱仪的样品，我们可以对数据库里的序列作一次虚拟的酶解。 质量排列 虚拟酶解的结果，产生了一系列的多肽，我们可以计算每个多肽的质量。 最后一个R的质量多加了18，这是因为我们写在下面的是残基的分子量。 质量排列的 把所有多肽的质量排序。 质量纹 如此，质谱图上的质量就可以与多肽上的质量相匹配。 质量纹 这就是多肽质量纹（PMF）的最基础的思路。 但是，真正的将之作为一个鉴定蛋白质的方法，还有很多需要考虑的问题。 在讨论这些问题之前，我们先看一看目前常用的质量纹算法。 常用的质量纹算法 现在试验中可用的算法有： Mascot: Profound: /cgi-bin/Profound Expasy tools: http://www.expasy.ch/tools/ PeptideSearch: http://mac-mann6.embl-heidelberg.de PMF中的问题 第一个问题：质量相近的多肽怎么处理？ 在现实的蛋白数据库中，多肽的数量是很庞大的。这里面难保不会有质量非常相近的多肽。这样，就造成了质谱图上的一个峰可能匹配不止一个多肽，于是我们就难以知晓这张质谱图究竟代表哪个蛋白。 质量相近的多肽 解决方案 第一个解决的办法是限制用来有哪些信誉好的足球投注网站的数据库。比如，你如果做的试验用的是小白鼠的组织，那么你可以只在鼠类的数据库中有哪些信誉好的足球投注网站，这样就可以减低出现这种情况的可能性。 第二个解决的办法是要求必须有多个多肽和数据库相匹配，才做出最后的蛋白质鉴定。 多匹配 长蛋白和短蛋白 第二个问题：长蛋白可能会更容易的被匹配。 因为长蛋白里的多肽数目较多，即以概率来算，匹配上的几率也会比较大。 质量纹算法必须考虑这个问题，给短蛋白一定的补偿。 多个蛋白的情况 第三个问题就是在一张质谱图中可能有多个蛋白存在。 通常，MALDI-TOF是与双向电泳连接使用。双向电泳的一个电泳点上可能有2-3个蛋白，这样就增加了鉴定的难度。 由于无法预知一个电泳点上有多少蛋白质，PMF的效果可能会受到很大的影响。 多肽质量纹：小结 质量纹算法是用一级质谱鉴定蛋白质的经典方法。 质量纹算法比较简单，一般使用较简单的统计模型，速度一般较快。 质量纹算法的效果受到很多方面的限制，首先是仪器精度的限制，其次是样品中可能有多个蛋白的限制。这使得质量纹算法不是理想的分析复杂混合物中蛋白成分的方法。 返回 利用二级质谱图 我们刚才谈到了，多肽质量纹有其先天的不足。其中，最糟糕的是它不能处理多个蛋白的混合物。 如果我们能够处理混合物，就可以减少很多用于纯化上的时间和精力。 那么，怎么才能从混合物中鉴定蛋白呢？这就要用到二级质谱。 二级质谱图 在一级质谱图中，选择其中的一个峰，对其进行CID过程，就得到一张二级质谱图。 这里的假设是一级质谱中的一个峰就对应了一个多肽，实际情况可能并不是这样。 先看一张二级质谱图，然后我们