猪巨细胞病毒DNA聚合酶基因的克隆与序列分析课件.ppt

猪巨细胞病毒DNA聚合酶基因的克隆与序列分析 学生姓名：xxx 学号：xxxxxxxxxxxx 年级专业及班级：2007级动物医学（动检）班 指导老师：xxx 副研究员 学院：动物医学院 摘要 本论文克隆了2株来自长沙和湘潭两地的两株猪巨细胞病毒(PCMV)的DNA聚合酶(DPOL)基因，其基因全长均为3024 bp，编码含1007个氨基酸的多肽。采用生物信息学方法对所测DNA及推导的氨基酸序列进行了分析，并与GenBank中已知的PCMV分离株的序列进了比较分析，发现这两株病毒间存在12个氨基酸差异，同源性为98.8%，与GenBank中其它已知毒株的同源性为99％-99.6％，表明DPOL基因在不同毒株间高度保守。本文结果为进一步研究PCMV的基因组特征提供了基础。 前言 1、PCMV 猪巨细胞病毒感染也称包涵体鼻炎，主要侵害猪的鼻甲黏膜、黏液腺、泪腺、唾液腺及肾小管上皮，在易感的种猪中可引起胎儿和仔猪发育不良、鼻炎和肺炎以及增重缓慢等临诊症状，成年猪多为隐性感染。由于该病毒的性质及病变分布与人的巨细胞病毒和豚鼠的唾液腺病毒相似，故称之为猪巨细胞病（porcine cytomegalovirus，PCMV)。 2、病理变化 感染该病毒之后病畜鼻甲骨粘膜呈扁平化，纤毛脱落，粘膜固有层见有圆形细胞浸润和水肿，特别是见有管胞状腺上皮细胞肥大和核内形成嗜碱性包涵体(此正常核大5～10倍)。 3、临床症状 仔猪该病常发生于1～3 周龄的仔猪， 发病程度与从初乳中获得母源性抗体的多少有很大关系。5～10日龄仔猪感染后，呈现急性经过，其主要症状是呼吸道症状，如喷嚏、咳嗽、流泪、鼻分泌物增多，继之出现鼻塞、吮乳困难，体重很快减轻。如果无母源抗体的仔猪感染，则可能发生鼻衄、颤抖和呼吸困难等症状，甚至在发病后5 d 死亡，1 窝感染该病的仔猪中死亡率可高达25 %。其他耐过的仔猪表现增重变慢、生长发育不良，并有可能持续排毒成为僵猪。 研究目的及意义 目前国内对于这个病毒基因的研究还不是很多 ，本文结果为进一步研究PCMV提供了基础。 目前PCMV的诊断方法 1 PCR诊断技术 2 血清学诊断方法 方法 根据GenBank中已知序列，在保守区设计PCMV检测引物和DPOL基因扩增引物。利用PCR扩增法获取DNA聚合酶基因片段序列，然后采用DNAMAN进行序列对比。 表 PCMV检测及DPOL扩增引物 Name Sequence (5’-3’) Expected product (bp) Purposeb PCMVDF PCMVDR GAATACACTGAAGCAAGCGATGATG AATCTCGGCAGCGGAAAAACAT 336 PCMV detection PCMV3F PCMV3R TTGCGGGTAAGGAGGCGTATT GTTTCGCTGGGCACTTCACAG 1241 Amplification of gB and DPOL PCMV4F PCMV4R GTAAAAATCTGCGTCAATGTGTT-3 GATTATTGGCTATCATTATGCTG-3 1366 Amplification of DPOL PCMV5F PCMV5R GGTTACTATGCTTCTCCAGTGATTGT CGGATGACATAAATGAAAAATACG 1040 Amplification of DPOL 结果 获得的两株病毒（湘潭，HN0601；长沙，HN0901）的DPOL基因编码区全长都是3024 bp，编码1007氨基酸的多肽，与其他已知DPOL蛋白具有相同的长度。十二个??氨基酸替换发现两者之间，他们之间的同源性为98.8％。同时与GenBank其他已知的四株病毒的DPOL基因进行比较 (其登录号分别为: AF268039, B6; AF268040:55B; AF268041:OF1;AF268042:489），发现我们所测的两株病毒的DPOL的氨基酸序列与它们具有99％～99.6％的相似性，而所有菌株的DPOL蛋白之间的同源性为98.8％～99.6％，表明DPOL基因在不同PCMV毒株间高度保守。 讨论 迄今为止，人们对PCMV的基因组和PCMV分子流行病学了解仍然十分有限，除了少数文献分别介绍了gB, MCP，DPOL外。对我国PCMV的DPOL基因还缺乏报道。在通过与其它毒株的DPOL基因的比较中发现其高度保守，该结果与其他疱疹病毒的DPOL的报道类似, 说明DPOL基因具有用于疱症病毒类型鉴定的潜在价值。 谢谢大家！