动物细胞养制药工艺.ppt

现代生物技术制药工艺 本章内容 动物细胞特征 昆虫表达系统 哺乳动物细胞系统 一、动物细胞特征 形态特征 细胞膜 细胞质 细胞核 没有细胞壁 亚细胞器 2.细胞代谢特征 动物细胞的不同代谢途径及其相应的酶体系定位于特定的亚细胞区域。 通过胞内运输（囊泡包裹）实现区域之间的物质、信息和能量流动，通过穿梭实现不同代谢途径之间的交换。 糖代谢特征 动物细胞吸收葡萄糖后，进行糖酵解，大部分葡萄糖分解为丙酮酸，进一步被还原为乳酸，乳酸分泌到胞外并在培养液中积累。 丙酮酸还可转化为乙酰辅酶A，进入三羧酸循环，彻底氧化产生CO2和水。小部分（4％～8％）葡萄糖进入戊糖磷酸途径，把葡萄糖转化为4、5、7碳糖和还原力NADPH，5碳糖用于核酸合成，其他中间产物进入脂肪酸代谢、核酸代谢和氨基酸代谢。 葡萄糖代谢旺盛，产生大量乳酸，对细胞产生毒性。 吸收谷氨酰胺，进入氨基酸代谢途径，合成其他氨基酸。 大多数谷氨酰胺在脱氨酶催化下，生成谷氨酸，并释放氨，对细胞产生毒性。小部分谷氨酰胺通过转氨生成其他嘌呤、嘧啶和氨基糖等合成代谢的前体。 谷氨酰胺的细胞能量作用：谷氨酸还原酶把谷氨酸转化为中间产物α-酮戊二酸，进入三羧酸循环，为细胞提供能量。 谷氨酰胺与丙酮酸和草酰乙酸发生转氨作用，生成丙氨酸和天门冬氨酸，丙氨酸进入培养液并积累。 快速生长的动物细胞培养体系，转氨作用是主要的代谢途径。 不同培养条件，葡萄糖和谷氨酰胺代谢重叠于丙酮酸。 流加葡萄糖或谷氨酰胺，控制整个代谢过程，避免有毒废物积累。 葡萄糖受限可增加谷氨酰胺消耗得以补偿，反之亦然。 谷氨酰胺是动物细胞的氮源，谷氨酰胺受限时，可增加其他氨基酸的消耗得以补偿。 蛋白质糖基化 N糖基化 不同细胞系糖基化能力 二、昆虫细胞表达系统与特征 昆虫细胞表达系统优点 昆虫细胞表达系统缺点 三、哺乳动物细胞表达系统 7.2 动物细胞培养的需求与培养基制备 一、动物细胞培养的营养需求 提供细胞生长的碳源和能源 主要是葡萄糖和谷氨酰胺 有时添加核糖等 3. 维生素 4. 无机盐类 细胞中核酸、磷脂等的组成成分 细胞代谢所需的酶的辅基 保持细胞的渗透压和缓冲pH的变化 碳酸盐缓冲液： 重要的体内缓冲体系，与K＋、Cl－等在维持酸碱平衡具有重要作用。 Na＋和Cl－参与生理电活动 维持水平衡、保持渗透压和酸碱平衡 生理盐水的离子浓度（0.9% NaCl） Ca2＋、Mg2＋，细胞间的互黏稳定作用。 离体培养，螯合细胞间的Ca2＋和Mg2＋，可以达到分散细胞的目的。 5. 生长因子与激素 激素：胰岛素、促卵泡激素、甲状腺素。 细胞因子：表皮生长因子、成纤维细胞生长因子和神经细胞生长因子。 贴附因子：纤维结合蛋白、胶原等 二、动物细胞培养的环境需求 水与渗透压 温度 氧气 pH 生长基质 抗生素 1.水与渗透压 水:细胞反应的重要介质 高渗溶液:高于310 mOsm/kg， 低渗透压溶液:低于280mOsm/kg 离体培养的渗透压应控制为等渗透溶液 增减NaCl的浓度调整渗透压，每增加1 mg/ml NaCl，渗透压增加32 mOsm/kg。 2.温度 不同种类的动物细胞对温度的要求是不同的 变温动物对温度要求没有恒温动物严格 哺乳动物细胞:37℃，鸡细胞：39－40℃，昆虫类细胞：25－28℃。 哺乳动物细胞的耐受温度范围较窄，在35-37℃内能正常进行代谢和生长，超出范围会引起细胞伤害甚至死亡。 细胞对低温耐受性比高温要强，低温抑制生长，但无伤害作用，冰点温度附近仍能存活。 3.氧气 动物细胞生长必须有氧气，无氧下，能获得能量供应，细胞缺氧时不能生存。 离体培养的气体含有5％CO2和95％空气，其中氧浓度为21％。 有时充以N2气稀释O2浓度。 高氧环境：O2浓度在60%以上，对细胞毒性较大。抑制生长和增殖，出现染色体异常。 4.pH 动物细胞对pH值很敏感，低于6.8或超过7.6会产生酸或碱中毒。 细胞代谢产生CO2，使培养液变酸。 合成培养基偏酸性，可用缓冲体系配制。 在开放体系中，CO2逸出，使培养基变碱。通入5％CO2，可维持在pH7.2-7.4范围内。 5.生长基质 概念：改变生长表面特性，促进细胞贴附的物质。 胞外基质成分，多聚赖氨酸、纤维连接蛋白、胶原、层黏蛋白、韧黏素等。 用PBS或BBS配成10倍贮存液，在37℃下包被，然后无菌生理盐水洗涤后使用。 直接加入培养液。 6.抗生素 培养基营养丰富，很容易被微生物污染。常添加抗生素，以避免轻度污染。 抗生素使用浓度范围为50～100 μg/ml。 大规模生产中，除了青霉素和β-内酰胺类抗生素外，其它抗生素可以使用。 抗生素使用对细胞会产生毒性 实验室保留抗药性微生物 三、动物细胞培养基的种类与组成 天然培养基 合成培养基 无血清培养基 1.天然培养基