禽流感免疫胶体金快速检测技术研究课件.ppt

Ab1、Ab2最佳工作浓度的选择的确定  用已知AIV标准抗原和阴性抗原进行了方阵滴定（3次重复），结果分析表明，选择Ab1浓度为1.25 μg/ml、Ab2稀释度为1:32000为最佳工作浓度。 灵敏度试验 以不同浓度AIV 标准抗原，做灵敏度试验，以OD450值为纵坐标，抗原浓度为横坐，制备标准曲线如图，线性检测范围在7.5ng/ml-500ng/ml，其线性良好，最低检测下限为3.75ng/ml。 对不同稀释浓度的AIV标准抗原进行检测，重复检测16次，浓度在7.5ng/ml-500ng/ml的结果为阳性。在7.5ng/ml与3.75ng/ml之间设7ng/ml、6.5ng/ml、6.0ng/ml、5.5ng/ml、 5ng/ml、 4.5ng/ml、4.0ng/ml几个浓度度，再次进行检测，当抗原浓度为5ug/ml时检测线反应结果较明现，抗原浓度为4.5ng/ml时反应结果不明显。初步判定AIV免疫胶体金层析法检测的灵敏度为5ng/ml。 7 6.5 6.0 5.5 5 4.5 4.0 3.75 阴性 AIV免疫胶体金层析法灵敏度测定结果 特异性试验 夹心ELISA法、AIV免疫胶体金层析法检测NDV、IBV、IBDV、MDV和禽流感标准抗原，用PBST液作空白对照。结果如下，双抗体夹心ELISA方法与AIV免疫胶体金层析法，特异性强，与其他禽病呈阴性反应。 待检样品 AIV NDV IBV IBDV MDV 空白 平均OD450值 1.376 0.078 0.073 0.074 0.079 0.062 AIV NDV MDV IBV MDV 空白 准确度试验 对标准曲线抗原高，中，低三个浓度的平均OD值检测，结果表明平均回收率为97.63％，说明所建立的双夹心ELISA法具有较高的准确度，在作为对照试验时可信度较高，保证了在进行检测时其他指标的可靠性。 抗原浓度 OD值1 OD值2 质控浓度 回收率（%） 平均回收率（%） 250 ng/ml 1.014 0.997 231.65 92.66 97.63 30 ng/ml 0.539 0.521 28.93 96.44 7.5 ng/ml 0.230 0.238 7.79 103.8 注：OD值1为相应标准抗原浓度对应的值 OD值2为在相应抗原浓度下实际检测所得值 精确度试验 对不同浓度标准AIV抗原在不同批次的检测结果如上，用双夹心ELISA法检测平均OD450值， 批内平均变异系数为4.99％；批间平均变异系数为5.92％；AIV免疫胶体金层析法的阳性检出率，批内平均变异系数为3.83％；批间平均变异系数为4.89％。表明这两种方法重复性好，符合率高，说明二者具有较高的重复性，其性能稳定。 抗原浓度（ng/ml） 双夹心ELISA 试纸条法 批内(5次) 批间(5)次 批内(5) 次 批间(5)次 平均OD值 CV% 平均OD值 CV% 阳性率(%) CV% 阳性率 CV% 250 0.998±0.031 3.1 0.994±0.042 4.23 99.0±1.98 2.0 98.5±2.058 2.62 30 0.551±0.028 5.08 0.554±0.030 5.42 98.0±3.43 3.5 97.4±4.71 4.84 7.5 0.235±0.016 6.8 0.234±0.019 8.12 96.51±5.79 6.0 94.16± 6.78 7.2 小结 建立了AIV双抗夹心ELISA法，作为胶体金试剂条检测法的参比方法，其线性良好，线性检测范围在7.5ng/ml-500ng/ml，最低检测下限为3.75ng/ml；该方法具有灵敏度高，特异性强，准确度高，重复性好等特点。 通过与AIV双抗夹心ELISA法比较研究表明，本试验所建立的AIV免疫胶体金层析法在检测AIV时，可检测出的下限是5ng/ml，与双抗体夹心ELISA法