种中药对奶牛子宫内膜炎主要病原菌的体外抑菌试验课件.ppt

8种中药对奶牛子宫内膜炎主要病原菌的体外抑菌试验 答辩人：尤天鹏 班 级：08动物医学 指导老师：何生虎 目 录 1.目的与意义 2.实验材料和方法 3.结果与分析 4.讨论 1. 目的与意义 奶牛子宫内膜炎（endometritis）是奶牛产后的常发疾病，也是引起奶牛不孕症的主要原因之一，引起奶牛繁殖能力降低。目前治疗奶牛子宫内膜炎主要使用抗生素药物，但是随着抗生素的大量应用,耐药菌株不断增多,且抗菌药物、激素等的应用不可避免地会出现奶中药物残留,给人类健康带来严重危害。 目前,国内许多学者把治疗子宫内膜炎的重点转移到中药上来,中药具有资源丰富、毒副作用小、残留少的优点。 本试验选取8种中药对子宫内膜炎的主要致病菌进行抑菌试验,在单味中药抑菌试验的基础上组方,确定复方的抑菌效果。为开发治疗奶牛子宫内膜炎的中药制剂提供科学依据。 2.实验材料和方法 2.1材料 2.1.1药材 黄连、黄芩、黄柏、苦参、大黄、金银花、连翘、蒲公英共8味中药，均购自宁夏德昇泰大药房连锁有限公司。 2.1.2菌株 选取宁夏吴忠市某奶牛场经临床诊断为子宫内膜炎的奶牛子宫分泌物，经实验室分离培养和生化鉴定筛选出的3中致病菌：链球菌（Streptococcus）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大肠杆菌（Escherichia Coli）。 2.1.3主要试剂 MH琼脂培养基和MH肉汤培养基,营养琼脂和营养肉汤培养基均购自北京奥博星生物技术有限责任公司，新生牛血清购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。 2.2实验测定方法 2.2.1单味中药最小抑菌浓度(MIC)的测定 ：用微量移液器依次加入普通营养肉汤（用于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌）和血清肉汤（含5%血清，用于链球菌）100μL，于灭菌的96孔细胞培养板每排1～10各孔中，在第一孔中加入试验药液100μL充分混匀后吸取100μL加入第2孔中,以此二倍稀释至第10孔，最后从第10孔中吸取100μL弃去，形成10个不同的浓度（500mg/ml、250mg/ml、125 mg/ml、63 mg/ml、31 mg/ml、16 mg/ml、8 mg/ml、4 mg/ml、2mg/ml、1 mg/ml），然后在每孔中加入稀释菌液10μL，第11、12孔分别为阴性对照组(不加入病原菌)和阳性对照组(不加试验药液)。轻微振荡1 min，使孔内溶液充分混匀。每排对应一种中药，依次完成8种中药。微孔板加盖并用纸胶带密封后放在铺有湿纱布的方形搪瓷盘中，于37℃温箱中培养18 h，以澄清透明孔所含最低药物浓度即为最小抑菌浓度MIC。 2.2.2单味中药最小杀菌浓度(MBC)的测定:分别吸取0.1ml上述药物最小抑菌浓度以上未见细菌生长的各孔培养物，移至普通琼脂培养基（用于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌）或血清琼脂培养基（含5%血清，用于链球菌）上，用无菌接种棒划线培养，置37℃培养箱中培养24h，观察有无菌生长，计数少于5个菌落者即为该药的最小杀菌浓度MBC。 2.2.3复方中药打孔法抑菌试验 ：取稀释后的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌液各100μL，分别均匀涂于普通MH琼脂板上；链球菌100μL均匀涂于含5%新生牛血清的MH琼脂板上。然后在平板上用6mm打孔器打孔，封底，每孔灌注复方中药药液100μL左右，每药重复2孔，对照孔加灭菌生理盐水。37℃培养24 h，准确测量抑菌圈直径。抑菌效果判定标准：。抑菌效果判定标准均按《中药药理学》标准抑菌圈直径≥20 mm为极敏，15～19 mm为高敏，10～14 mm为中敏，l0mm为低敏 3.结果与分析 3.1单味中药最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度---（MBC）测定结果 ： 结果分析： 对金黄色葡萄球菌，效果最好的为黄连，MIC为4mg/mL，MBC为8mg/mL； 对大肠杆菌，效果最好的为黄芩和大黄，MIC为16mg/mL，MBC为31mg/mL； 对链球菌，效果最好的为黄连和苦参，两者MIC为16mg/mL，MBC黄连为16mg/mL、苦参为31mg/mL。 试验结果表明，黄连、黄芩、苦参、大黄对3种致病菌的综合抑制作用较强，MIC为4-16mg/mL，MBC为8-31mg/mL，这说明上述几种药物质量浓度达到31mg/mL时,均能抑制这3种病原菌的生长。 3.2复方中药打孔法抑菌试验结果 :