流式细胞术及其应用ppt课件.pptVIP

* 流式细胞仪对一个样品提供的结果是否可信，虽然与仪器操作者的水平有很大关系，但在很大程度上取决于样品制备的优劣。细胞密度太低，影响测试速度并造成测试参数调整的困难，尤其是在做DNA分析时，由于细胞太少，势必要提高样品的流速，人为地增大了G0/G1期的CV值，影响了结果的可靠性；非特异荧光强，则造成样品结果的假阳性；聚集体增多，尤其是肉眼可见的细胞聚集体，可造成流式细胞仪进样针的阻塞，影响仪器的性能，碎片可干扰测试结果，造成结果分析的困难。 流式样品制备过程中常见的问题及解决对策 常见问题 原 因 解决对策 细胞密度低 制备过程中细胞损失 增加离心时间、吸弃上清 非特异荧光强 抗体不纯、死亡细胞多 选择纯度高的抗体、用同型对照抗体或双标记排除非特异荧光 碎片多 细胞死亡、机械损伤 在细胞生长状态良好时测试、避免反复吹打 细胞聚集 消化不完全、酒精固定造成的细胞粘连 彻底消化、在用酒精固定细胞时加入终浓度为1.5-3％的小牛血清 荧光弱 灵敏度不够、抗体加入量不饱和、反应时间短 改用生物素-亲和素、增加抗体用量、延长反应时间 测不出亚二倍体峰 凋亡测试方法选择不当 改用原位末端标记或Annexin-V和PI双标记法 ㈢样品对照 细胞的荧光有自发荧光、非特异荧光和特异荧光，并且流式细胞术提供的阳性细胞百分比和荧光强度都是相对阴性细胞而言的，所以在样品制备中样品对照的设置至关重要。①在测DNA时，要设正常细胞对照，即不做任何干预的细胞对照。②在检测细胞膜CD分子和细胞内蛋白或细胞因子时，要设同型抗体对照，如果是双标记或三标记检测，还要设单标记的阳性对照。 六、流式样品的制备： ⒈细胞DNA分析： 用本法可测定细胞周期、细胞倍体和凋亡，在样品制备中存在的问题主要是细胞的聚集和碎片，建议在固定细胞时加入1.5%-3%小牛血清。 ①培养的细胞系、体液中分离的有核细胞或分离的组织细胞约1×106，离心沉淀后用0.3ml 含5%-10%小牛血清的PBS悬浮，移入预先加有0.7ml无水乙醇的EP管中，置-20℃固定细胞24小时以上（用本法制备的细胞可在-20℃保存一周甚至更长的时间）。在分析肿瘤细胞的倍体时，要同时加入PBMC作为内参，PBMC与肿瘤细胞的比例为1:2）。 ②3000rpm离心细胞1分钟，吸弃上清，用1ml PBS重悬细胞，再离心洗涤细胞一次，吸弃上清，沉淀细胞用100μl 1mg/ml RNase A悬浮，37℃30min以消化RNA，再加入400μl 50μg/ml PI，置暗处10min后上机检测。 ③结果分析：流式报告中可给出G0/G1、S、G2/M各期细胞的百分比、凋亡百分比和细胞倍体。 GFP/DNA双参数分析 在分析转染了绿色荧光蛋白（GFP）的细胞的细胞周期时，用GFP/DNA双标记法分析GFP表达阳性细胞的细胞周期，以观察基因表达蛋白对细胞周期的影响，是目前最好的技术方法。 方法为先用0.5%多聚甲醛预固定细胞30-60分钟，以保护GFP，防止其荧光的卒灭，再用70%乙醇固定。流式报告中可给出GFP阳性细胞和阴性细胞的细胞周期、GFP的转染效率和表达量。 胞内蛋白/DNA双参数分析 在分析胞内（胞浆或胞核）蛋白与细胞周期的关系时，也可用间接免疫萤光法先标记胞内蛋白，再用PI标记DNA。这种样品需要先用乙醇固定细胞，用破膜剂打孔，以便抗体能进入细胞内与靶蛋白结合，再用萤光二抗标记细胞。最后加入PI，上流式测试，分析方法与前述方法一样。 ⒉细胞表面CD分子检测（以小鼠脾细胞CD3、CD4、CD8为例）： ①小鼠脾脏用注射器芯轻轻研磨，过200目滤网，将细胞滤于含5%小牛血清的PBS中，吸取0.1ml（约1×106）置离心管中，加入CD3-PE-CY5、CD4-FITC及CD8-PE抗体（加入量参照供应商的推荐量，一般抗体的加入量为1μg /1×106/0.1ml ），室温30min。 ②加入细胞裂解液2ml 室温裂解RBC 15min，用PBS洗涤细胞两次，吸弃上清，沉淀用0.5ml PBS悬浮，上机检测；也可用2%多聚甲醛固定，4℃避光可保存至少24小时。用CD3设门法分析，流式报告中可给出CD3阳性细胞中CD4和CD8阳性细胞的百分比和荧光强度。通过流式报告计算出CD4与CD8的比值。 注意两点：①建议使用流式专用的RBC裂解液。②离心后上清一定要吸，不能倒，离心速度控制在3000rpm左右，1分钟即可。 ⒊细胞内细胞因子测定：