生化分离工程复习ppt课件.ppt

生化分离工程 复习 据各种资料统计，分离纯化过程所需的费用要占产品总成本的很大比例，按产品不同。 对抗生素生产而言，分离纯化部分的投资费用约为发酵部分的4倍；对有机酸或氨基酸生产而言，则为1.5倍；对基因工程药物，分离纯化技术的要求更高，如重组DNA蛋白质精制的费用可占整个生产费用的80~90%；对于血液制品，分离纯化几乎占整个生产费用的100%。 因此人们逐渐认识到下游工程的落后有可能会阻碍生物技术的发展。 一、 分离纯化的一般步骤 (1) 发酵液的预处理和固液分离 ； (2) 初步分离(提取) ； (3) 高度纯化(精制) ； (4) 成品加工。 二、多肽和蛋白质的纯化 多肽和蛋白质的纯化包括两部分内容。 一是将蛋白质与非蛋白质分开，二是将不同的蛋白质分开。 对非蛋白部分可以根据其性质采用适当的方法去除。而对于不同蛋白质的分离则可以利用它们之间性质上的差异进行。常用的方法有: (一)利用溶解度不同的纯化方法 有盐析法、有机溶剂法、等电点沉淀法、加热变性法等。 (二)利用分子形状和大小不同的纯化方法 凝胶层析法、透析法等。 (三)利用电离性质不同的纯化方法 离子交换法、电泳法等。 (四)利用生物功能专一性的不同纯化蛋白质 亲和层析法等。 三、蛋白质分离纯化举例 3.1 重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（human granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF）是一种可由体内多种细胞产生的细胞因子，如激活的T、B淋巴细胞、成纤维细胞、内皮细胞等，可作用于造血干细胞，促进其增殖、分化，形成中性粒细胞和巨噬细胞群，同时还能刺激噬酸性粒细胞、巨核细胞、多浅能性和早期红细胞的形成和增殖。 1993年获美国FDA批准重组GM-CSF（rhGM-CSF）用于临床。主要用于治疗肿瘤化疗产生的造血障碍、再生障碍性贫血、骨髓异常增生综合征等，还用于增强免疫、骨髓移植等。 3.1.1 GM-CSF的特性 分泌到细胞外的成熟人由127个氨基酸残基组成，分子量为22kD。 不同来源的GM-CSF分子量范围为14.5kD?35kD，分子量差异是由糖基化程度不同造成的。但糖基化程度不同的GM-CSF生物学活性却没有明显的不同，甚至有报道大肠杆菌表达的非糖基化GM-CSF比真核细胞表达的糖基化GM-CSF具有更高的生物学活性。 GM-CSF的分子由两个反向平行的?折叠和四个反向平行的?螺旋组成，有两个二硫键分别连接螺旋B和?折叠的第二条链、螺旋C和羧基末端。 rhGM-CSF的pI为5.4。 3.1.2 GM-CSF的分离和纯化 本例是以包涵体的形式进行表达的。 I)．收集菌体细胞 发酵后的工程菌以7000r/min离心30min，用50mmol/L Tris-盐酸缓冲液反复洗涤、离心3次，去上清液。 II)．细胞破碎与包涵体的收集 沉淀（菌体细胞）加4倍体积20mmol/L磷酸盐缓冲液(含5mmol/L EDTA)，冷浴搅匀，置超声破碎器中破菌，每次30s，间隔30s，反复破碎直至革兰染色镜检无完整的菌体止。5000?g离心30min，去上清，沉淀即含有包涵体。 3.1.2 GM-CSF的分离和纯化 III)．包涵体的洗涤 上述沉淀加入9倍体积20mmol/L磷酸盐缓冲液(含0.5%TritonX I00)，5000?g离心30min，沉淀加入9倍体积20mmol/L磷酸盐缓冲液(含0.5mol/L脲)，同法离心，沉淀加入6倍体积20mmol磷酸盐缓冲液(含5mmol/L EDTA)，以10000?g离心30min，收集沉淀。 IV)．包涵体的变性与复性 上步沉淀加入8mol/L脲溶液，振摇l2h，40000?g离心30min。用逐步稀释法将上清液脲浓度稀释至0.lmol/L，复性24h，以17000?g离心30min，上清液即为复性的rhGM-CSF粗产品。 3.1.2 GM-CSF的分离和纯化 V)．色谱法纯化 V-I）疏水色谱 将Phenyl-Sepharose 6 FF色谱柱用50mmol/L磷酸-7%（NH4)2SO4液(pH6.9)平衡。 复性粗产品加入（NH4)2SO4 使其浓度达7%(w/v)，上样。 用50mmol/L磷酸-7%（NH4)2SO4液(pH6.9)、20mmol磷酸盐缓冲液（pH7.0）及30%异丙醇依次洗脱，280nm紫外检测，收集洗脱峰，电泳（银染色）检定。 3.1.2 GM-CSF的分离和纯化 V-II）离子交换色谱 装DEAE-Sepharose FF色谱柱，以20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)平衡至基线。 加上步得到的目的产物