生化第四章氨基酸刘ppt课件.ppt

注意： 脯氨酸与羟脯氨酸与茚三酮反应生成 亮黄色化合物，最大吸收在440nm处。 侧链R基参加的反应 蛋白质的化学修饰 在温和的条件下，以可控制的方式使蛋白质与某种试剂发生特异反应，引起蛋白质个别氨基酸侧链或官能团发生共价化学改变。用于结构与功能的研究 氨基酸混合物的分析分离 分离方法 柱层析 纸层析（相对迁移率，非极性性质） 薄层层析 离子交换层析（电荷和非极性） 气相层析 高效液相层析 氨基酸洗脱顺序的判定：氨基酸与树脂的亲合力主要决定于它们之间的静电吸引，其次是氨基酸侧链与树脂聚苯乙烯之间的疏水相互作用；亲和力愈大愈难洗脱！ 层析分离 根据蛋白质的形态、大小和电荷的不同而设计的物理分离方法。共同特点:一个固定相和流动相，当蛋白质混合溶液(流动相)通过装有珠状或基质材料的管或柱(固定相)时，由于混合物中各组份在物理化学性质(如吸引力、溶解度、分子的形状与大小、分子的电荷性与亲和力)等方面的差异使各组分在两相间进行反复多次的分配而得以分开。流动相的流动取决于引力和压力，不需要电流。 用层析法可以纯化得到非变性的、天然状态的蛋白质。层析方法中凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等是目前最常用的层析方法。 层析原理 分配定律 :Kd=cA/cB 有效分配系数：Keff=某物质在A相中的总量/某物质在B相中的总量 Keff=Kd*Rv, Rv=VA/VB 逆流分配（反流分布法） 是连续操作的多次液一液提取的分离方法。被分离的各个组分在两种不相混溶的溶剂中有不同的分配系数，以不同程度分配在两相中，其中一个相不断地向前移动，同时不断添加新鲜溶剂进行提取，经过多次操作后即可将复杂混合物分离。此法需要经过多次振摇提取，因而逆流分配代谢是由大量容器管连接组成，采用自动操作、自动提取分离。逆流分配仪体积较大，比较复杂，在使用上受到一定限制 64 溶剂 A 溶剂 B 总量 64 32 32 16 16 16 16 8 8 16 16 4 4 8 8 12 12 12 12 4 4 2 2 8 8 12 12 8 8 2 2 平衡后 总量 32 32 总量 64 转移1 转移3 转移2 转移4 总量 16 32 16 总量 8 24 24 8 总量 4 16 24 16 4 分管号码 1 2 3 4 5 物质Y(Kd=1) 的分配情况 理论塔板数与粒子半径成反比 理论塔板决定层析效果 因此层析载体的粒径越小，分离效果越好。这就是为什么要发展高效液相色谱（HPLC） 理论塔板数 将色谱柱比作蒸馏塔，把一根连续的色谱柱设想成由许多小段组成。在每一小段内，一部分空间为固定相占据，另一部分空间充满流动相。组分随流动相进入色谱柱后，就在两相间进行分配。并假定在每一小段内组分可以很快地在两相中达到分配平衡，这样一个小段称作一个理论塔板（theoretical plate），一个理论塔板的长度称为理论塔板高度（theoretical plate height）H。由于色谱柱内的塔板数相当多，因此即使组分分配系数只有微小差异，仍然可以获得好的分离效果。 理论塔板数（number of theoretical plate）又称理论塔片数，用?n 表示：为完成某一指定分离要求所需理论塔板的数量，即组分流过色谱柱时，在两相间进行平衡分配的总次数。描述色谱柱效能的一项主要指标，当色谱柱长为L时，则它的理论塔板数?n 为： n=L/H? ?或? H=L/n 当色谱柱长L固定时，n 值越大，或H值越小，柱效率越高，分离能力越强。n 和H可以等效地用来描述柱效率。 高效液相色谱法是以液体作为流动相，并彩用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。 HPLC适于分析分离不挥发和极性物质。对样品的适用性广，不受分析对象挥发性