禽传染性支气管炎病毒s1基因与猪iggfc基因的克隆及在hela细胞中的融合表达ppt课件.ppt

禽传染性支气管炎病毒S1基因与猪IgGFc 基因的克隆及在Hela 细胞中的融合表达 背景综述 目的及意义 技术路线 研究内容 结果与分析 致谢 报告提纲 背景综述 病 原 体：IBV（单股正链RNA病毒，有囊膜） 流行病学：呼吸道排毒;飞沫传播；潜伏期短；急性， 高度 接触性；自然感染仅发生 于鸡,雏鸡发 病最为严重；低温是发病的关键。 临床症状：损害呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统等； 呼吸型、肾型、腺胃型等； 检测诊断：病毒分离、病毒中和、血凝抑制试验、RT－ PCR；ELISA、AGP 防 治： 预防为主（环境＋疫苗），治疗为辅 禽传染性支气管炎(IB) 结合受体，诱导中和抗体、 血抑抗体、CTL反应 S蛋白 E蛋白 M蛋白 N蛋白 infectious bronchitis virus IBV 参与病毒装配（与核衣壳相互作用，将其结合到囊膜 ） 具有大量抗原决定簇，能诱导产生中和抗体 参与病毒粒子的释放 IBV病毒粒子结构 背景综述 背景综述 S 蛋白：裂解为S1(90kD)和S2(84kD)的两个亚单位， 均为糖蛋白。 S1蛋白：由520～538个氨基 酸组成。 S1功能：别并结合宿主细胞膜上特异性糖蛋白受体 参与膜融合 氨基端参与决定毒株的组织亲和性及毒力 抑制多数中和抗体 IBV S1蛋白 117 37 160 N 81 269 298 C 亲水区 疏水区 强亲水区 S1蛋白(520-538AA)抗原决定簇 背景综述 IgG 水解: 2 Fab +Fc 大小相近,活性不同 Fab：结合抗原 Fc：结合活化补体 哺乳动物IgGFc 段能与SPA、 SPG非特异性结合;将目的基因 与IgGFc 基因融合表达，利于鉴 定和纯化！ 免疫球蛋白IgGFc段 IgGFc 目的及意义 克隆猪IgGFc 和IBV S1基因，为进一步开发以这两个基因为基础的疫苗和诊断方法做基础。 表达S1-IgGFc，以IgGFc为蛋白标签，以期进一步利用亲合层析或免疫沉淀法，进行IBV细胞受体的分离与鉴定 。 技术路线 扩取IBV S1基因 扩猪 IgGFc 基因 融合表达载体 转染 Hela 细胞 培养Hela 细胞 表达鉴定 研究内容 一. 猪IgGFc 基因的克隆和序列分析 二. IBV S1基因的克隆和序列分析 三. 表达载体的构建 四. 重组表达载体在 Hela 细胞上的表达 结果与分析 猪IgGFc 基因扩增 一. 猪IgGFc 基因的克隆和序列分析 扩增区域：铰链区——C末端 不包括信号肽 目的片段：1002 bp 上 游：EcoRI 位点 下 游：XhoI 位点 猪IgGFc 基因的RT-PCR扩增 pMD18T－IgGFc 构建 图 pMD18T-IgGFc/EcoRI+XhoI酶切 鉴定:EcoRI+ XhoI 阳性：2680bp+1002bp 猪IgGFc 基因的克隆和序列分析 IgGFc 序列分析 测序结果： 所获序列(略)1002 bp，与预期一致，无终止子，334个氨基酸 Blast比对： 100％ gi5052049, g gi433127 94% gi33125 蛋白预测： 分子量大小约37 kD 等电点为6.58 在体内半衰期约100h， 不含跨膜区 不含信号肽，与预期相符 猪IgGFc 基因的克隆和序列分析 二. IBV S1基因的克隆和序列分析 IBV S1基因的克隆 S1基因PCR产物的电泳分析 模板：含M41株S全长的质粒 目的：19～536氨基酸 上游 BamHI，下游EcoRI 去掉了信号肽 保留裂解识别位点部分碱基，以增加空间距离 pMD18T-S1构建 pMD18T-S1鉴定 鉴定:BamHI+EcoRI 预期:2680 bp＋1554bp pMD18T-S1 BamHI+EcoRI酶切 禽IBVS1基因的克隆和序列分析 IBV S1序列分析 测序： 所获序列（略）大小1554 bp，与预期一致，无中止子，含518个氨基酸 Blast：99％ AY561712.1 （ M41株S1基因） 蛋白预测： 稳定蛋白 等电点8.17， 分子量为58.9 kD，在哺乳动物体内半衰期超过30h 不含跨膜区 没有信号肽 禽IBVS1基因的克隆和序列分析 三. 载体构建 载体构建流程图 顺序选择： S1位于上游 S1功能区N端 pcDNA3.1-IgGFc 的构建 pcD