生化21 常用分子生物学技术的原理及应用PPT课件.ppt

第二十一章;第 1 节分子印迹与杂交技术;一、核酸分子印迹与杂交技术; 在杂交之前，通常用琼脂糖凝胶分离待测的DNA分子，再将分离的DNA片段转移到特定的支持物上。由于转移后各个DNA片段在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位置一样，故称为印迹（ blotting）。 ;（一）Southern印迹杂交;; 基因组DNA的定性与定量分析。 如对在基因组中特异基因的定位及检测等。 重组质粒和噬菌体的分析。;（二）Northern印迹杂交;Northern印迹杂交的基本过程 ;相同点：;;二、蛋白质印迹技术(Western blotting); 首先将混合蛋白质用PAGE按分子大小分开，再将蛋白质转移到NC膜上，蛋白质的位置可保持在胶中的原位上。;蛋白质的转移只有靠电转移 蛋白质的检测以抗体作探针 用碱性磷酸酶（ALP）、辣根过氧化酶（HRP）标记第二抗体，底物显色来检测蛋白区带的信号，底物亦可与化学发光剂结合以提高敏感度。 或用同位素标记第二抗体，放射自显影法检测蛋白区带的信号。;Western blotting应用;三种印迹技术的比较;第 2 节 PCR技术的原理与应用; PCR技术是1985年由美国科学家Kary B Mullis建立的体外扩增基因片段的方法，它具有特异、敏感、产率高、简便、重复性好、易自动化等突出优点，是分子生物学技术中一项具有革命性的创举。;5?;Cycle 3;模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+ ;二、PCR技术的主要特点;2. 采用PCR方法获得目的基因 引物选择：特异引物、随机引物、简并引物 ;（二）基因的体外定点突变 （三）基因突变分析 （四） DNA和RNA的微量分析 （五） DNA序列测定; (Sanger双脱氧链终止法);DNA链末端合成终止法;DNA自动测序 ;DNA自动测序结果;四、几种重要的PCR衍生技术;RT-PCR技术;实时PCR技术原理;第 3 节转基因技术与基因剔除技术; 是指将外源基因整合到动物细胞或植物细胞的基因组中并使外源基因在动物细胞或植物细胞中稳定遗传和表达的技术。 ; 即体细胞克隆技术，是用显微操作、电融合等方法将动物体细胞的细胞核全部导入另一个个体的去除细胞核的卵细胞内，使之发育成为个体。; 核转移技术可使一个细胞变成一个个体，这???产生的个体所携带的遗传物质与细胞核供体的遗传物质完全一样，是一种无性繁殖的过程，即克隆(clone)。;通过分子生物学的方法定向地敲除动物体细胞内的某个基因的技术称为基因剔除 (gene knock-out)或基因打靶 (gene targeting)。;四、基因转移和基因剔除在医学中的应用;第 4 节??? 生 物 芯 片 技 术;DNA芯片(DNA chip)、DNA阵列(DNA array) cDNA芯片(cDNA chip) 指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上。; 将探针与荧光标记的待测样品分子进行杂交，通过检测系统检测杂交的荧光信号和强度，从而获取样品分子的数量和序列信息。 ; 将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。;基本原理： 蛋白质与蛋白质分子之间在空间构象上能特异性的相互识别和相互结合。如抗体与抗原或受体与配体之间的特异性结合。 最常用的探针： 抗体，抗体与抗原结合的特异性最强。 检测方法： 标记检测法、直接检测法;第5节 蛋白质相互作用研究技术; 1989年美国纽约州立大学的Fields和Song首先描述了酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)。 该系统的建立是基于对酵母转录因子Gal4分子的研究。; 这两个结构域各具功能，互不影响, 单独存在时没有转录激活的功能，只有两者通过共价或非共价键连接建立起来的空间结构方可表现出一个完整的激活特定基因表达的激活因子的功能。;（二）酵母双杂交系统的应用;基因组学与蛋白质组学 ; 基因组学是研究生物体基因组的结构、结构与功能的关系、以及基因之间相互作用的科学;二、基因组学的研究内容; 功能基因组学是建立在结构基因组学研究基础上的基因组分析 ;蛋白质组学; 蛋白质组学是从整体水平研究细胞内蛋白质的组成、结构及其活动规律的科学。 蛋白质组学是对不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体的研究. ;二、蛋白