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第4章蛋白质的化学ppt课件
第五节 蛋白质的性质 一、蛋白质分子的大小、形状及分子量的测定 分子量>10000 蛋白质; < 10000 多肽 P87 胰岛素分子量为5437,习惯上称为蛋白质 形状:根据其不对称常数,将蛋白质分为球形、椭圆 形、纤维状 分子量测定常用方法: ①分子筛层析法 ②SDS-聚丙烯凝胶电泳(SDS) ③生物质谱 ①.分子筛层析法测定蛋白质分子量大小 凝胶颗粒 收集蛋白质管 蛋白质混合物 大分子 从柱上面加缓冲溶液 小分子 洗脱体积(Ve) 凝胶柱 大分子 小分子 Ve1 Ve2 V0 ②. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量大小 3.生物质谱(MS)测定蛋白质分子量大小 二、蛋白质的变性 某些理化因素使蛋白质分子的空间构象发生改变或破坏,导致其生物活性的丧失和一些理化性质的改变的现象。 变性的本质 —— 破坏非共价键和二硫键, 不改变蛋白质的一级结构 变性作用的因素 物理因素:高温、紫外线、X-射线、超声波、剧烈振荡等 化学因素:强酸、强碱、尿素、去污剂、重金属、三氯醋酸、浓酒精等 变性作用的意义 变性的特征: 生物活性的丧失 某些理化因素 的改变 溶解度降低,易沉淀 不对称性增加 粘度增加 扩散系数降低 分子结构松散,易被水解 天然状态,有催化活性 尿素、 β-巯基乙醇 去除尿素、 β-巯基乙醇 非折叠状态,无活性 三、蛋白质的两性电离及等电点 蛋白质是两性电解质,其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。 等电点(pI) 在某一pH的溶液中,蛋白质所带正负电荷相等,净电荷为零,此时溶液的pH值称为该蛋白质的等电点。 CH NH2 COOH R pH=pI +OH- pHpI +H+ NH3+ COO- CH NH2 COO- R +OH- +H+ pHpI CH COOH R NH3+ 蛋白质的兼性离子 阳离子 阴离子 R CH 四.蛋白质的胶体性质 + + + + + + + 带正电荷的蛋白质 - - - - - - - - 带负电荷的蛋白质 水化膜 水化膜 蛋白质形成亲水胶体的因素: ①蛋白质表面有水化层 ②蛋白质表面具有同种电荷 五、蛋白质的沉淀反应 蛋白质分子从溶液中析出的现象,称为蛋白 质的沉淀。 1.中性盐沉淀:硫酸铵、氯化钠 2.有机溶剂沉淀反应:乙醇、苯酚 3.加热沉淀反应: 4.重金属盐沉淀反应:重金属中毒 5.生物碱试剂:药检(三氯醋酸) 六、蛋白质的颜色反应 P93 1.茚三酮反应:氨基 2.双缩脲反应:肽键 3.酚试剂反应:酪氨酸、 色氨酸 七、蛋白质的免疫学性质 1.抗原,抗原性 2.抗体 单克隆抗体 多克隆抗体 3.蛋白质免疫性质的应用 免疫预防:疫苗 免疫、诊断治疗 二、蛋白质的分离与纯化 利用不同蛋白质溶解度不同、分子大小不同、电离性质不同、配基特异性不同确定使用不同的纯化方法 (一)利用溶解度不同的分离纯化方法 1.等电点沉淀 2.盐析沉淀 3.低温有机溶剂沉淀法 4.温度对蛋白质溶解度的影响 0-40℃之间,大部分蛋白质溶解度随温度升高而增加,40-50℃以上开始变性而沉淀。因此蛋白质分离一般在0℃或更低的温度下进行。 超过滤 加压 蛋白质溶液 半透膜 支持膜的栅板 超滤液 半透膜袋 蛋白质溶液 透析液 磁棒 磁力搅拌器 透析 (二)根据分子大小不同的分离纯化方法 1.透析和超过滤 2.凝胶过滤 3.密度梯度离心 2.分子排阻层析 未知 logMr 洗出液中的蛋白质浓度 洗脱体积(mL) 层析的主要设备 3.密度梯度离心法 滴加样品 蔗糖密度梯度 蔗糖浓度 CsCl密度梯度离心 (三)根据电离性质不同的分离纯化方法 1.电泳法:带点质点在电场中向电荷相反的方向移动。 ①醋酸纤维膜电泳 ②聚丙烯酰胺凝胶电泳 ③等电聚焦电泳 ④免疫电泳 ⑤二维电泳 2.离子交换层析:离子交换纤维素、 离子交换凝胶、 大孔型离子交换树脂 等电聚焦电泳 2.离子交换层析分离蛋白质 蛋白质浓度 洗脱体积 带正电荷的蛋白质 带负电荷的蛋白质 收集样品的管 收集样品的管 带负电荷的蛋白质 蛋白质混合物 玻璃柱 带正电荷的蛋白质 带负电荷的蛋白质 带正电荷的蛋白质 收集样品的管 NaCl NaCl梯度 (五)利用配体的特异性
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