细胞冷冻保存技术ppt课件.ppt

步骤　　　 从液氮取出冻存细胞，立即投入盛有38摄氏度温水的容器内，摇动冻存管，使其内容物在20-60秒内完全溶化成悬液。无菌下打开冻存管，接种于培养瓶中,加入新鲜培养液，37摄氏度孵箱培养24小时更换培养液去除冻存液，继续培养。 * 广泛应用的细胞保存方法是：低温冷冻保存法 * 由于细胞浓度低时失活较显著．因此需将细胞浓度调到一定密度为易． 动物细胞培养的方法 之 细胞冷冻保存技术 细胞的低温保存 细胞低温冷冻贮存是细胞培养的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞遗传性状的改变和延缓衰老。 目前，动物细胞一般保存于液氮中 （-196℃）。 一般在原代或传代2－10次内即大量冻存，作为原种（stock cells），取一支细胞进行传代繁殖，用毕再冻存，这样可保证长期使用和延缓衰老 。 根据细胞冷冻液在在冻结后是否形成冰晶，低温 冷冻保存细胞可分为： 1．非玻璃化冷冻 　　细胞在冷冻过程中，细胞内和细胞外的水形成冰晶。 2．玻璃化冷冻 　　细胞在冷冻过程中，细胞内和细胞外的水不形成冰 晶，而是形成玻璃态。 非玻璃化冷冻 原则：缓慢冷冻 原因：当温度降低到冰点以下时，细胞内外的水分就会 形成冰晶。细胞内形成的冰晶会造成细胞膜和细 胞器的损伤。这种损伤称为细胞内冰晶损伤。 细胞外的水形成冰晶后，使得未结冰的溶液中的 电解质的浓度升高，细胞在这种高浓度的溶质中 时间过长，会使细胞膜上的脂质受到损害，细胞 膜破裂，这种损害称之为溶质损伤。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶，从而减少细胞内冰晶对细胞的损伤；相反，结晶很大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。 在细胞冻存时加入冷冻保护剂，可以保护细胞免受冷冻损伤。 原理：1.常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，降低细胞的冰点 2.提高胞膜对水的通透性，促进细胞内水渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少冰晶对细胞的损伤；解冻时，促进细胞外水进入细胞内，缓解渗透性肿胀。 3.稀释细胞内外未结冰溶液中的电解质，减少溶质损伤。 解决办法：冷冻保护剂的应用 在培养液中添加的保护剂： 二甲亚砜（Dimeethylsulfoide,DMSO）， 甘油,可使细胞免受低温冰晶形成、及渗透压改变而导致的物理损伤。 预先配制冻存保护液： 含20%血清培养基，10%DMSO，DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞； 冻存和复苏的原则：慢冻快融 　　当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 　　如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶很大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。 冻存培养细胞 (1)预保留细胞经消化分散后，用将其预冷却，4度 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（1- 5 ×106细胞/ml)； 冷冻保护剂降温时减少细胞内冰晶分子的形成，以免对细胞造成伤害。 (2)加入1ml细胞悬液于冻存管中，在火焰下将安瓿封口。密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。 可用带有18G针头注射器进行分装，如剂量过大，保护剂对细胞渗透作用不匀，冷冻效果不好。 (3)加保护剂的细胞悬液经缓慢冷冻，结冰产生在细胞外(对细胞没有损伤)。如果要长期保存，可以使用液氮罐， (4)冻结好的安瓿放入低温冰柜或液氮罐中。温度达-150~-190 ℃ ，细胞几乎处在停止状态。 冷冻时带手套操作，以免冻伤。 慢冻程序 标准程序： 当温度在-25℃以上时， 1～2℃/min 当温度达-25℃以下时， 5～10℃/min 当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中 缓慢冷冻的简化程序 配置冷冻保护液 在培养液中加入 血清（一般20%） 10% 甘油或 DMSO 将冷冻液加入离心管，使 细胞浓度为 2~6×106cell/ml 将冷冻液分装到冷冻管中 4℃冰箱放置30-60min-----20 ℃冰箱放置2小时 （冷冻管放入泡沫盒或用棉花纱布包裹）-70℃冰箱放置1-2天 投入液氮罐 取旺盛生长的细胞,消化后用离心管离心回收细胞 在没有程序控制