胎儿有核细胞筛选技术概述ppt课件.ppt

母体外周血胎儿细胞筛选 2011.11.22 背景介绍 美国2006年发布的“全球出生缺陷报告”中显示 ：全世界每年出生缺陷儿超过800万，90%发生在中低收入国家，每年至少有330万 5岁以下儿童死于出生缺陷，约320万存活缺陷儿终生残疾。 我国是世界上出生缺陷高发国家之一，全国出生缺陷总发生率约为11‰- 14‰，且呈逐年上升趋势。中国每年有约2000万婴儿出生，其中约有20-30万肉眼可见先天畸形儿，加上出生后数月和数年才显现出来的缺陷，中国先天残疾儿童总数高达80-120万，约占每年出生人口总数的4％-6％。 2007年全国前 5位的出生缺陷疾病依次为：先天性心脏病、多指 (趾)、唇裂、神经管缺陷和先天性脑积水，发生率分别为25. 1/万、16. 3/万、13. 1/万、7. 2/万和 6. 8/万。 据统计，我国目前的出生缺陷死亡率为30%，残疾率为40%，只有30%可以治愈或纠正。如果对所有存活的出生缺陷和残疾提供治疗、康复和福利，全国每年要投入300亿元人民币。 * 产前诊断 * 又称宫内诊断，是指胎儿出生前采用各种方法预测其是否有先天性疾病（包括畸形和遗传性疾病），为能否继续妊娠提供科学依据。 目前真正能做到产前诊断的病种很少，可分以下几类： (1) 染色体病 (2) 性连锁遗传病 (3) 先天性代谢异常 (4) 血液系统遗传病 (5) 胎儿的神经管畸形 (6) 胎儿先天畸形 产前诊断方法包括创伤性方法和非创伤性方法，从形态学、染色体、酶学、代谢产物和基因五个水平进行。目前产前诊断仍以创伤性方法为主，并以羊膜腔穿刺最为常用。 产前诊断方法 * 创伤性产前诊断方法主要包括： 绒毛膜穿刺术：采取羊膜囊之外的绒毛膜，进而分析胎儿的染色体，最早可在怀孕10-12周进行。 羊膜穿刺术：目的是为取得羊水中的胎儿细胞，在怀孕大约14-20周进行。羊水细胞主要来自胎儿的皮肤、胃肠道、呼吸道、泌尿生殖道的粘膜脱落细胞。经体外培养后，可进行染色体分析、酶和蛋白质检测、性染色质检查、提取DNA作基因分析，也可不经培养，用微量技术作酶和蛋白质分析或直接提取DNA作基因诊断。 胎儿镜和胚胎活组织检查：主要用于胎儿血的取样、活检，也可对胎儿形态异常进行观察，于怀孕15-21周进行操作。 脐血取样：经母腹抽取胎儿静脉血，可在B超引导下于孕中期、晚期（17-32周）进行。 创伤性产前诊断可能引起流产（绒毛膜穿刺1.4-2.7%，羊膜穿刺0.5%）、早产、感染、母体免疫反应、胎儿畸形、甚至胎儿死亡等并发症。 非创伤性产前诊断方法主要包括： 超声检查 X线或核磁共振成像检查 母体血清检测：AFP，β-hCG等 母体外周血胎儿细胞检测 * 母血中主要存在两种来源的胎儿细胞，一种是胎盘细胞，如合体滋养细胞和细胞滋养细胞；另一种是胎儿血细胞，如淋巴细胞、粒细胞及胎儿有核红细胞。 滋养细胞是最早出现在母血中的胎儿细胞（孕4-5周起），但在进行产前诊断最佳时期即孕早期时，只有极少量的滋养细胞出现在母血中。滋养细胞可以在体外培养，但其多核特征及嵌合型核型会干扰遗传学结果分析，不利于用于产前诊断。 胎儿淋巴细胞于孕14周出现于母体血循环中。有学者利用HLA-A2抗原作为标记，结合FACS从孕妇外周血中分离到胎儿细胞。但由于HLA抗原系统有较高的个体特异性，且需知道父母双方的HLA类型，所以将它直接用于临床还有一定的困难。同时，由于胎儿淋巴细胞产后可持续存在于母体数年，故诊断可能受既往妊娠的影响。 针对胎儿粒细胞的研究较少，可能是特异性单克隆抗体较难寻找。 目前认为胎儿有核红细胞是用于产前诊断的最理想细胞类型： 从孕6周至分娩持续存在于母体外周血中； 每40ml母血中有100-1000个，而正常人外周血中几乎没有； 在母血中生命周期较短，约为90天； 属单核细胞，含有胎儿的全部遗传信息，且易从形态学上辨别； 表达数种特异性抗原，如转铁蛋白受体CD71，以及独特的胎儿血红蛋白ε, γ链等。 母体外周血胎儿细胞 目前许多学者都致力于解决胎儿细胞的识别、富集和如何排除母血的“污染”等。已有用单克隆抗体或以细胞表面特异性抗原的抗体作为标记等来识别胎儿细胞，结合富集和纯化技术的完善，如果方法能更加简便、经济，将可能在遗传病的预防中发挥作用。 富集方法： 化学方法：根据抗原-抗体结合，如FACS、MACS； 物理方法：根据细胞密度或在电场和缓冲液中的迁移，如梯度离心、电泳迁移。 纯化技术： 胎儿细胞的标记； 单细胞操作技术。 外周血胎儿细胞筛选 * 方法 原理 备注 FACS 荧光染料标记的抗体与细胞表面特异性抗原标记物结合，然后用流式细胞仪进行分析。 FACS方法可以高纯度富集、分类细胞，允许多参数分类，并适合于细胞内抗原的应用[1]。 MACS 使用磁珠