Ch4 沉淀法(Pricipitation)2.ppt

一、沉淀法的概念： 二、沉淀法的优点： 三、沉淀法的分类： 5、用盐析法分离蛋白质时可以有两种步骤： Ks盐析法：在一定pH和温度下，改变体系离子强度进行盐析的方法 β盐析法：在一定离子强度下，改变pH和温度进行盐析的方法 其中，Ks盐析法由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。 而β盐析法由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的纯化。 三、（NH4）2SO4盐析法实际应用时的注意点： ②直接加固体硫酸铵到被分离的溶液中，按下式  计算加入量：W= （g） S2、S1—分别为所需达到的硫酸铵饱和度和原来 溶液的硫酸铵饱和度（均用小数表示） 0℃ ，W= (已考虑体积的增加) 因此，如果我们说，沉淀某一种蛋白质需要60%饱和度的硫酸铵，那么需要硫酸铵固体的量是多少？ 由于在等电点附近，溶质仍然有一定的溶解度，等电点沉淀法往往不能获得高的回收率，因此等电点沉淀法通常与盐析、有机溶剂沉淀法联合使用 操作时的注意事项： （1）由于无机离子的影响，蛋白质的等电点通常会发生“漂移”，阳-高，阴-低 （2）溶质的稳定性 （3）盐析效应 优点： 大多数Prot、pI＜7，而无机酸价廉,易被蛋白质类食品所允许不必除酸。 发酵液中Glu含量在4%以上时，等电结晶（pI为3.22）操作容易，收率可达60%左右， Glu含量太低，如在1.5~3.5%之间常温下溶液的过饱和率较小，结晶的生成速度慢，收率低， 三、有机溶剂沉淀法 （一）有机溶剂沉淀法：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。 原理： （1）降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。 （2）由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低了亲水性，导致脱水凝聚。 四、其它沉淀法 二、等电点沉淀法 （二）操作条件： 离子强度低，pH≈pI（略小于pI在中性盐存在下），用无机酸（HCl、H2SO4、H3PO4等）调节pH (一)等电点沉淀的概念: 适用于憎水性较大的蛋白质的沉淀,对亲水性的目标产物常与其它方法结合起来使之沉淀。 用该法沉淀杂蛋白及其它杂质.（如胰岛素的纯化）pI=5.3 （三）适用范围： 缺点： 酸化时易使Prot 失活。由于Prot对Prot、对低pH比较敏感。 发酵 起晶中和点 pH 4.0~4.5 ↓ ↓ 等电搅拌 pH 3.0~3.2 ↓ 菌体 静置沉降 4~6h ↓ 母液 离心分离 ↓ 谷氨酸 图2：等电点法提取谷氨酸的工艺流程图 ↓ 盐酸 停酸育晶2h 谷氨酸的含量： 因此，对产酸较低的发酵液，为了提高收率，中和时采用多加高流分子（离子交换柱洗脱下的高脱液，加酸调至1.5 ,用于等电中和） ，以增加谷氨酸含量，同时，在晶核形成前投入晶种，以促进结晶的形成。 此外，也可在去菌种后在70℃下进行真空浓缩，然后在等电点提取，也可采用离子交换柱，直接吸附分离，再等电结晶。 * * 第四章 沉淀法（Pricipitation） 第四章 沉淀法（Pricipitation） 第一节 概述 1、中性盐盐析法 2 、等电点沉淀法 3、有机溶剂沉淀法 4、非离子型聚合物沉淀法 5、聚电解质沉淀法 6、金属离子沉淀法等 （一）盐析法（Salting-out）的概念和基本原理： 1、概念： 2、基本原理 （P41） 一、中性盐盐析法 第二节 盐析法 从以上分析可知，在蛋白质溶液中加入中性 盐后会压缩扩散双电层，降低ζ电位，即中性 盐既会使蛋