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伪狂犬病病毒主要毒力基因缺失后的免疫原性研究 第34卷第5期西南民族大学?自然科学版 JournalofSouthwestUniversityforNationalities?NaturalScienceEdition 0ct.2008 文章编号:1003—2843(2008)05.0943.06 伪狂犬病病毒主要毒力基因缺失后的免疫原性研究 阳爱国,2郭万柱,徐志文,石谦一,宋振辉 (1.四川农业大学动物生物技术中心,四川雅安625014;2.四川省动物防疫监督总站,四川成都610041) 摘要:本试验研究伪狂犬病病毒(PRV)基因缺失疫苗株DI,D2和D3的免疫原性.对4周龄仔猪按不同剂量分别 肌注接种D1,D2,D3后,于7,14d后采血;14d后用10PFU强毒株PRVFa滴鼻攻毒所有试验猪,攻毒7d后检查PRV 在猪体内器官的分布.基因缺失毒株接种后试验组仔猪体温略有升高,接种部位未发生炎性反应,不向外散毒.PRvFa 攻毒后试验组的仔猪体温稍有升高但不超过40,对照接毒组连续4d均超过4O,有1头出现明显神经症状并死亡.强 毒攻毒后,各剂量免疫组散毒均为2～3d,而对照组,同居猪散毒均为5d.对照组10个器官组织(大脑,小脑,三叉神 经,心,肺,肝,肾,淋巴结,脾和扁桃体)均检测出PRV;D1组除大脑,小脑,肺脏外均检测出PRV;D2,D3组除 大脑,小脑外,其它均检出PRV.免疫组的保护率均为100%,对照组为75%.试验结果表明D1,D2和D3能对接种猪 提供充分的保护;攻毒后疫苗接种猪都向外排毒,但散毒天数均远低于对照组且未从同居感染猪中分离出病毒;D1,D2 和D3是具有高度免疫原性且接种安全的基因缺失疫苗株. 关键词:伪狂犬病;基因缺失疫苗株:免疫原性 中图分类号:$858.28文献标识码:A 伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是以发热,奇痒及脑脊髓炎为主的传染病….目前,其已成为仅次于口蹄疫和 猪瘟的危害养猪业的重要疫病,该病在世界上分布广泛,并有不断蔓延扩大的趋势【2,引.目前在欧美等国家,通 过使用包含gE基因缺失的弱毒苗,结合gE一鉴别ELISA可区别开疫苗接种猪和野毒感染猪,淘汰野毒感染猪 后既可达到净化伪狂犬病的目的【4J. 伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)DI,D2,D3基因缺失株是通过基因操作,分别在PRVFa株缺失其 毒力单基因TK,双基因gEI,三基因TK/gE/gI构建而成的I5,.本实验主要通过其与PRVFa株比较来研究其 免疫原性和安全性. 1材料与方法 1.1毒株,试验动物及主要试剂 DI,D2,D3基因缺失株:由四川农业大学动物生物技术中心构建;PRVFa毒株:由中国兽药检察所提供;标 准PRV阳性血清由四川农业大学动物生物技术中心提供.试验猪:3周龄断奶仔猪25头,购自雅安市名山县;试 验前采血检测为PRV血清阴性.Vero细胞,由本实验室提供;试剂DMEM培养基胰酶,和小牛血清为Gibco 公司产品;琼脂糖,甲基纤维素为Sigma公司产品. 1.2病毒增殖 取致密单层的Vero细胞,倾出培养液,接种病毒液0.5mL,37~C吸附1h后,再加入含2%犊牛血清的DMEM, 置37~CCO2培养箱培养,48h后,将培养瓶置一70~C冰箱,冻融3次,3000r/min离心10min,收取上清液,一70~C 保存备用. 1-3蚀斑试验 在6孔盘上培养的Vero细胞形成单层后弃营养液,将待测病毒液用无血清营养液进l0倍系列稀释后,选择 合适稀释度分别接种于各孔内(留一孔作对照),每孑L0.1mL,轻轻摇匀,37~C吸附1h后,加入l%的甲基纤维素覆 收稿日期:2008.07.18 作者简介:阳爱国(1967一),男,博士,四川农业大学动物生物技术中心高级兽医师,主要从事动物传染病病原分子生物学研究 基金项目:四川省科技厅应用基础项目(03JY029-040) 944西南民族大学?自然科学版第34卷 盖培养基.37*(2CO2培养箱培养64h后,将覆盖的甲基纤维素吸出,加lmL福尔马林.结晶紫吲定染色液I直j定和 染色感染细胞,20min后,j}j自来水轻轻冲洗,观察,计数蚀斑.并计算出病毒原液每毫升所含PFU. 1.4实验动物分组 25头4周龄断奶仔猪购自名山县农户;分成4个组,即Dl,D2,D3,对照组;D1～D3每组7头(含J啬=『居 组l头)接种剂量0.1mL,0.01mL,0.001mL各2头;对照组4头.试验前所有动物经血清学检测均为PRV阴 性.在严格隔离条件下进行试验. 按分组肌肉注射接种,D1,D2,D3原液每毫升所含蚀斑单位调整为10PFU,7,14d后采血;14d后用10PFU PRVFa株滴鼻攻毒所有的各组试验猪.在攻毒后对猪每日