医学毕业论文--重组人Jo自身抗原的克隆、 原核表达及抗原特异性鉴定.doc

重组人Jo1自身抗原的克隆、 原核表达及抗原特异性鉴定 作者：赵晓瑜, 毕智丽, 吴亦红, 辛海涛 【摘要】 　　目的: 旨在获得高纯人Jo1抗原（即组氨酰tRNA合成酶）。方法: 利用RTPCR从人胎盘总RNA中获得Jo1的编码基因, 并分别用IMPACTCN和pMAL系统的pTYB11、 pMALc质粒, 构建了表达载体, 转化至大肠杆菌ER2566、 BL21。结果: 经筛选与鉴定, 得到阳性重组子诱导表达后均获得Jo1融合蛋白。Western blot显示, 这两种融合蛋白都具有Jo1抗原特异性, 即仅与含Jo1抗体的多肌炎和皮肌炎自身免疫病患者血清反应, 而与正常人以及188例含有其他自身抗体（分别为RNP阳性、 Sm阳性、 Ro/La阳性和RNP/Ro阳性）的患者血清均为阴性反应。结论: 在两种表达载体中, pMALcJo1的表达量超过菌体蛋白的50％, 而且以可溶性形式存在, 有利于分离纯化, 为临床检测创造了条件。 【关键词】 Jo1; 基因; 表达; 抗原特异性 　　氨酰tRNA合成酶是胞内酶, 由“管家”基因编码, 可在所有组织中表达, 主要催化包括蛋白质合成过程中的氨基酸活化和氨酰tRNA复合物的形成两步反应。人组氨酰tRNA合成酶（HSHRS）还是一类结缔组织病（自身免疫疾病）中的横纹肌弥漫性炎症疾患多肌炎（polymyositis, PM）和皮肌炎(dermatomyositis, DM)的标志性自身抗原［1, 2］, 临床上称之为Jo1, 相对分子质量（Mr）为55 000, 由509个氨基酸组成, 基因全长1 527 bp［3, 4］。因PM和DM患者的血清中含有特异性的抗Jo1抗体, 故Jo1可用于临床鉴别和诊断多肌炎和皮肌炎［5-8］。我们利用基因重组的方法获得重组Jo1自身抗原, 为开发自身抗体的临床检测试剂创造了条件。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 质粒pTYB11、 pMYB5, 大肠杆菌ER2566、 BL21为BioLab公司产品。TRIzol Reagent为Invitrogen公司产品。MMLV Reverse Transcriptase、 T4 DNA Ligase为Promega公司产品, Spe I、 Pst I为TaKaRa公司产品。正常人血清、 Jo1阳性血清和各种结缔组织病阳性血清, 来自北京协和医院、 首都医科大学和天津长征医院, 二抗羊抗人IgGHRP, 由北京生物制品所生产。 　　1.2 方法 　　1.2.1 重组质粒的构建 液氮速冻人胎盘组织, TRIzol法提取总RNA。根据GenBank注册序列X05345, 利用Primer Premier5.0软件设计嵌套引物进行反转录和巢式PCR, 获得Jo1全长基因。Spe I、 Pst I双酶切质粒pTYB11、 pMALc, 并对线性质粒进行去磷酸化, 用T4连接酶将回收的双酶切pTYB11、 pMALc与目的DNA片段进行连接, 获得带有Jo1基因的重组质粒, 应用CaCl2法将重组质粒转化大肠杆菌ER2566、 BL21菌株。 　　1.2.2 重组子的筛选与鉴定 pTYB11和pMALc质粒载体携带有氨苄青霉素抗性基因, 以氨苄终浓度为0.1 g/L配制LB平板初筛转化子。提取转化子质粒, 琼脂糖凝胶电泳观察质粒大小, 并用质粒作模板进行特异性扩增和双酶切鉴定。利用pTYB11载体自带的正向测序引物以及设计中间引物由上海联合基因科技（集团）有限公司进行全基因测序, 利用BLASTn对测序结果进行序列同源性分析。 　　1.2.3 Jo1基因在大肠杆菌ER2566、 BL21中的诱导表达与产物分析 37℃过夜菌转接后培养至A600为0.8左右, IPTG（终浓度0.3 mmol/L）30℃诱导培养6 h后收集部分菌体, 直接进行SDSPAGE分析, 其余菌体进行超声波破碎（缓冲液: 50 mmol/L TrisHCl, 0.5 mmol/L EDTA, 9 g/L NaCl, 50 g/L甘油）, 分别对上清和沉淀进行100 g/L SDSPAGE。将100 g/L SDSPAGE胶上样品转移到PVDF膜上, 分别用两份Jo1阳性血清、 12例正常人和188例其他自身免疫性疾病患者血清（包括RNP阳性、 Sm阳性、 Ro/La阳性和RNP/Ro阳性）进行Western blot检测。 　　2 结果 　　2.1 Jo1基因的获得 根据GenBank中的编码人组氨酰tRNA合成酶的mRNA（X05345）的成熟蛋白编码序列, 利用Primer Premier 5.0软件设计嵌套引物: 引物I: 5′ACAGCAGGCGGCTC