医学细菌的形态结构观察简单染色革兰氏染色课件.ppt

细菌的形态结构观察 ——简单染色、革兰氏染色 一、目的要求 1、观察细菌菌落的特征。 2、掌握简单染色法、革兰氏染色法的原理及操作步骤。 二、基本原理 细菌个体微小，且较透明，必须借助染色法使菌体着色，显示出细菌的一般形态结构及特殊结构，在显微镜下用油镜进行观察。根据细菌个体形态观察的不同要求，可将染色分为三种类型即简单染色、鉴别染色和特殊染色。 1、简单染色法原理 这是最基本的染色方法，由于细菌在中性环境中一般带负电荷，所以通常采用一种碱性燃料如美蓝、碱性复红、结晶紫、孔雀绿、蕃红等进行染色。这类染料解离后，染料离子带正电荷，故使细菌着色。 2、革兰氏染色法原理 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的重要鉴别染色法，通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。 革兰氏染色过程所用四种不同溶液的作用： （1） 碱性染料 草酸铵结晶紫液。 （2） 媒染剂 碘液，其作用是增强染料与菌体的亲和力，加强染料与细胞的结合。 （3） 脱色剂 乙醇将染料溶解，使被染色的细胞脱色。利用不同细菌对染料脱色的难易程度不同，而加以区分。 （4） 复染液 蕃红溶液，目的是使经脱色的细菌重新染上另一种颜色，以便与未脱色菌进行比较。 革兰氏染色有着重要的理论与实践意义，其染色原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，经乙醇处理发生脱水作用，使孔径缩小，通透性降低，结晶紫与碘形成的大分子复合物保留在细胞内而不被脱色，结果使细胞呈现紫色。而革兰氏阴性菌肽聚糖层薄，网状结构交联少，而且类脂含量较高，经乙醇处理后，类脂被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，因而细胞壁被脱色，再经蕃红复染后细胞呈红色。 三、实验器材 1、菌种 培养24h的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。 2、染液 （1） 简单染色 草酸铵结晶紫染液。 （2） 革兰氏染液 草酸铵结晶紫染液、革兰氏碘液、95%乙醇、蕃红染液。 3、其他物品 显微镜、载玻片、香柏油、擦镜纸、接种环、蒸馏水、染色架。 四、实验步骤 1、简单染色步骤 （1） 涂片 取洁净的载片一张，将其在火焰上微微加热，除去上面的油脂，冷却，在中央部位滴加一小滴蒸馏水，用接种环在火焰旁从斜面上挑取少量菌体与水混合。烧去环上多余的菌体后，再用接种环将菌体涂成直径约1cm的均匀薄层。制片是染色的关键，载片要洁净，不得沾油污，菌体才能涂布均匀。注意初次涂片，取菌体量不应过大，以免造成菌体重叠。 （2） 干燥 涂布后使其自然干燥或在酒精灯焰高处（距火焰8~10）。 （3） 固定 将已干燥的涂布标本向上，在灯焰上通过3～4次进行固定。固定的作用为：（a）杀死细菌；（b）使菌体蛋白质凝固，菌体牢固粘附于载片上，染色时不被染液或水冲掉；（c）增加菌体对染液的结合力，使涂片易着色。 （4） 染色 在涂片处滴加草酸铵结晶紫溶液1～2滴，使其布满涂菌部分，染色1 min。 （5） 冲洗 斜置载片，倾去染液。用水轻轻冲去染液，至流水变清。注意水流不得直接冲在涂菌处，以免将菌体冲掉。 （6） 吸干 用吸水纸轻轻吸去载片上的水分，干燥后镜检 （7） 镜检 将染色的标本，先用低倍镜找到目的物，将低倍接物镜转开，滴加一小滴香柏油于涂片处，用油镜进行观察。注意各种细菌的形态和细菌的排列方式。观察完毕，注意清洁油镜。 3、革兰氏染色法 （1） 涂片 取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌制成涂片，干燥、固定。 （2） 染色 用草酸铵结晶紫染液染色1 min，用水冲洗。 （3） 媒染 滴加革兰氏碘液冲去残水，并用碘液覆盖1 min，用水冲去碘液。 （4） 乙醇脱色 以95%乙醇脱色20~30s。立即用水冲洗净乙醇并用滤纸轻轻吸干。脱色是革兰氏染色的关键，必须严格掌握乙醇的脱色程度。若脱色过度则阳性菌被误染为阴性菌；若脱色不够则阴性菌被误染为阳性菌。 （5） 复染 蕃红染液复染1 min，水洗。 （6） 吸干并镜检 若研究工作中要确证未知菌的革兰氏反应时，则需同时用已知菌进行染色作为对照。 （1） 绘图：画出大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的细胞形态图。 （2） 记录革兰氏染色结果；分辨出革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。如果染色结果不理想，请分析原因。 五、实验结果 （1） 为什么必须用培养24 h以内的菌体进行革兰氏染色？ （2） 要得到正确的革兰氏染色结果，必须注意哪些操作？哪一步是关键步骤？为什么？ （3） 当你对未知菌进行革兰氏染色时，怎样保证操作正确，结果可靠？ 1、病毒性肝炎：由病毒造成的