生物化学实验课件生化实验2010.6.30.ppt

实验器材 实验二 蛋白质的比色定量分析 ——考马斯亮蓝法 实验目的 熟悉分光光度计的基本原理和使用方法 掌握利用考马斯亮蓝定量分析蛋白质的方法 思考题 1.考马斯亮蓝 G-250 法测定蛋自质含量的原理是什么？ 还有哪些蛋自质定量法？ 2.考马斯亮蓝法测定蛋自质含量时，应该注意些什么？ 利用蛋白质-染料结合的原理，定量测定蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G-250在游离状态呈红褐色，当它与蛋白质结合后变为蓝色，前者最大吸收波长为488nm，后者为595nm。在一定蛋白浓度范围内（0.01~1.0mg/ml），蛋白质-色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量分析。蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合2min左右达到平衡，完全反应十分迅速，其结合物在室温下1小时内保持稳定。 实验原理 762分光光度计 （1）分析天平（2）移液器（3）试管、试管架（4）离心机、离心管（6）烧杯、量筒（7）分光光度计 主要试剂 1、生理盐水：称0.9g NaCl，用蒸馏水定溶至100mL。 2、蛋白质标准液（1 mg/ml）：称小牛血清白蛋白100mg，用蒸馏水定溶至100mL。 4、考马斯亮蓝G-250溶液：称100mg考马斯亮蓝G-250，加95%乙醇50mL，加85%（W/V）H3PO4 100mL，用蒸馏水定溶至1000mL，置棕色瓶过夜，再用二层滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G-250，4.7%(W/V)乙醇。 ?一、制定标准曲线——常量法标准曲线 实验操作 OD595nm 摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色 各5ml 考马斯亮蓝试剂(ml) 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.1 蒸馏水(ml) 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0.0 1mg/ml标准蛋白溶液(ml) 5 4 3 2 1 0 试管编号 取6支10ml干净试管 按下表取样，混匀，放置2min。在?595nm 下比色，纪录数据。以OD值为纵坐标、标准蛋白含量（mg/ml）为横坐标作图，得到标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的OD值，即可查出未知样品的蛋白含量。 制备待测样品：已准备好。 二、未知样品蛋白质浓度测定 测定：取1 支10mL 试管，按下表取样。 0.1 待测样品提取液（ml） 5 考马斯亮蓝G-250试剂（ml） 蛋白质浓度（mg/ml ） OD595nm 1 管 号 测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量可以忽略。测定结束后，可用乙醇将比色杯壁上的蓝色洗干净。 注意事项 计算结果 OD595nm值对应的标准曲线蛋白质含量（mg/ml） 样品蛋白质浓度(mg/ml)= ×稀释倍数