分子生物学实验一基因组NA制备和目的基因扩增.ppt

* * 实验仪器的使用及注意事项 ：（1：25~1：30） * * （1）吸头的安装要紧密：（2）吸取液体前，先打到第一挡：第一挡为实际读数体积，第二挡为帮助彻底打出液体，避免吸头内液体残留。 （3）将吸头插入液面下，不易过深或过浅：（4）缓慢松开拇指，吸取液体。（5）完全放开拇指后，吸头在液面下停留一下（约半秒钟）：（6）抬起加样器，观察吸头外壁上是否挂有液体。将外壁液体用容器口引流回容器： 尤其国产吸头容易沾附液体。 （7）将液体匀速打到目的容器内，加样器推到第二挡：速度不易过快。 （8）取下加样器头，放到废物盒内。如果需要吸取相同液体，吸头没有被其他试剂污染，可不换吸头。 * 按箭头所示，讲解离心机使用程序： * 简单介绍一下真核细胞和真核细胞基因组，及我们今天实验的几部分内容（模板DNA的提取、电泳） 目的要求: 学习和掌握从动物组织中提取核酸的原理和操作技术 了解提取DNA/RNA的几种方法，原理和优缺点 学习测定DNA/RNA含量的基本原理及具体方法 * 置50°C水浴50分钟讲解： 能溶解入10％一l5％的水分，因溶解的水分而损失部分DNA (酚不能抑制RNAase的活性, 溶解掉部分ploy(A)RNA) * 置50°C水浴50分钟讲解：但以2价离子镁氯化镁的沉淀效率最高，还能提供Mg2+稳定DNA。 * 实验第二部分（2：50~3：30） 实验前讲解： 1）本实验将用到的TE饱和重蒸苯酚、氯仿/异戊醇是有机试剂，比水的比重大，而DNA溶解在水里，达到分离DNA和杂质的目的； 2）介绍实验步骤； 3）强调注意事项（不能将加样器倒置，以防液体导流损坏加样器：尤其在抽取氯仿、苯酚等有机试剂时）。 1）? 模板DNA由于太大，非常容易受机械剪切而断裂，因此，为了得到完整的基因组DNA，尽量不要多次进行物理性操作，如用加样器反复吹打等，有时需要将加样器头尖剪断，以防由于太细造成基因组DNA通过狭小通道而断裂。 实验中到学生中间指导实验。 * 注意事项：教师在实验中到学生中间指导实验。 * 步骤8）时注意：完整基因组DNA有一个物理特性，就是比较粘，因此，如果基因组DNA黏度还在，一般情况下可以认为完整性尚可。 * 实验第三部分：60~80分钟。（3：30~4：00） * 要。 * * 小图为教师做的予实验结果。由于在一个反应体系中有很多条基因组DNA，因此，理论上说，内切酶可以切割出相差一个碱基的DNA片段。 本次实验使用未经酶切的DNA样品电泳，由于片段大，在加样孔附近可看到一条很亮的DNA带。 如果采用底部加热的方式，将会造成管内液体的蒸发，严重影响反应体系的准确性！ 一般说来，基因片段的长度为750 bp左右时， 通常可按下列条件进行PCR： * 分子生物学实验 1、 守纪律，听老师安排，穿白衣 2、 课间休息、上课时间。 3、 每组做一份实验； 4、 同学们在听课时要作好记录; 考试形式 闭卷考试（80分) (卷面满分100分，＊0.8后计入总成绩) 平时作业（10分）(理论课思考题，各班班长收齐后上交) 实验报告（10分）(两次实验课，一次5分，内容包括实验名称、实验目的、原理、实验结果分析和思考题) 实验课安排 提取基因组DNA 重组质粒 连接产物转化 无质粒的E.Coli 死亡 有质粒的E.Coli 存活 PCR获取目的基因 重组质粒提取及酶切 质粒 TA 连接 T载体 平板筛选 实验一 基因组DNA的制备和目的基因扩增 实验二 PCR产物的T-A连接及连接产物转化 实验课内容 ?一、加样器的使用及注意事项 1、 用途 2、 使用 2.1 根据取样量，选择合适的加样器。 5ul、50ul、500ul，应选择哪个加样器? 顶部标有加样器的最大量程， 分别为： 20ul: 0.5 ~ 20 ?l 100ul: 20 ~ 100 ?l 1000ul: 100ul ~ 1000 ?l 实验仪器的使用及注意事项 练习：加样器读数为 100，实际体积各为多少? 2.2 如何调节？ (1)首先观察目前读数,假设为050: 1000 ?l: 500 ?l 100 ?l: 50 ?l 20 ?l： 5 ?l (2)顺时针调节--- 读数变小 逆时针调节--- 读数变大 (3)注意：调节前加样器读数正处于最大量程或最小量程时，如果向错误方向调节，马上会超出量程，将会损害加样器的精度。 2.3 加样器使用步骤(示教及学生练习)： 6）(吸