分子生物学实验实验六pcrzxfor 八年制.ppt

思考问题 如何大量扩增目的基因 如何模拟DNA复制 如何保证复制的特异性 PCR扩增仪的作用 PCR扩增仪的作用 PCR仪可以迅速而精确的调节反应温度,保证每一个循环中变性,退火,延伸时温度和时间的准确。连续调节30次,就可以完成30个循环。 PCR进行过程中温度可达90℃以上,为避免反应体系中水分的蒸发, PCR仪设计了热盖装置。如果没有热盖可以在反应管的液面上加一层石蜡油覆盖。 实验六 PCR (Polymerase Chain Reaction) 多聚酶链反应 支秀玲 zhixiuling@ 实验目的 以实验五所提的HL60细胞基因组DNA为模板，以c-myc基因为靶基因设计、合成引物，扩增出329bp的扩增产物。 学习并掌握PCR的基本原理与实验技术。 实验原理 多聚酶链反应（PCR）技术的原理类似于DNA天 然复制过程。可简述为： 微量离心管中加入缓冲液，模板DNA ， dNTP， 耐热Taq聚合酶及两个合成的DNA引物。经以下三 个步骤反复进行： 高温变性： 94-96℃ 退火： 50-65℃ 延伸： 72℃  1 cycle 2 cycle 3 cycle PCR原理示意图 实验试剂 1）模板DNA：为HL60细胞基因组总DNA 2）2×Es Taq MasterMix ：康为世纪 3）引物 1（100μmol/L）：由生工生物公司合成 4）引物 2（100μmol/L）：由生工生物公司合成 5 ) 无菌ddH2O 6 ) 1×TAE： 0.04 mol/L Tris-乙酸 0.001 mol/L EDTA 7 ) Agarose : 已称取1.2g在三角烧瓶内，加入60mL 1×TAE即配成2% Agarose凝胶 8 ) 核酸染料：GelRedTM Nucleic Acid Gel Stain（10,000×） 实验试剂 2×Es Taq MasterMix 由Es Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg2+、 dNTPs以及PCR稳定剂和增强剂组成的预混体系，浓度为2x。 预配好的PCR混合液使操作更加简单快捷，可最大限度地减少人为误差和污染。 含染料的2x Es Taq MasterMix可以在PCR程序结束后取适量样品直接进行电泳操作。 实验器材（略） 制胶及电泳相关器材：琼脂糖凝胶电泳槽，电泳仪，紫外观察仪，200ml三角烧瓶等 PCR扩增相关器材：0.2ml薄壁管，PCR扩增仪（ABI） 其他：旋涡振荡器，台式离心机，加样枪及枪头等 实验步骤 1.取一只0.2 ml PCR薄壁管，依次加入： ddH2O 8.5μL 2×Es Taq MasterMix 10 μL Primer 1 （10 μmol/L） 0.5 μL Primer 2 （10 μmol/L） 0.5 μL Template （0.5 μg/μl） 0.5 μL 总体积 20 μL 注意： 1.吸取样品前短暂离心 2. 加样顺序（模板最后加） 3. 加样后混匀，短暂离心 4.管壁上写好组号,盖紧盖子 实验步骤 2. 振荡混匀，短暂离心，放入PCR扩增仪中。 94℃预变性5分钟； 进入循环： 94℃变性60秒 57℃退火30秒 30个循环 72℃延伸30秒 72℃延伸5分钟。 同时设置PCR扩增仪的热盖温度为105℃。 实验步骤 3.配制2％的Agarose凝胶 称取1.2 g Agarose放入200 mL三角烧瓶中，加入60 mL TAE溶液，微波炉中加热令其完全溶解，稍作冷却后加入GelRed 核酸染液 6μL（稀释10,000倍）。浇板，水平放置，待凝。 琼脂糖浓度 　　 0.3 　0.6　 0.7　 0.9　 1.2　 1.5　 2.0 线状DNA大小/kb 5-60　1-20　0.8-10　0.5-7　0.4-6　0.2-4　0.1-3 4.上样电泳： 取10μl PCR样品 取5μl DNA Marker Ⅰ上样电泳 凝胶成像观察条带。 DNA Marker Ⅰ电泳带型（ 2%Agarose）