分子生物载体 5 .ppt

载体的功能 1. 为外源基因提供转入受体细胞的转移能力； 2. 为外源基因提供在受体细胞中的复制或整合能力； 3. 为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达提供必要的条件能力。 理想载体至少必备的条件 ① 能在宿主细胞中自主复制 ② 容易进入宿主细胞 ③ 容易插入外来核酸片段 ④ 容易从宿主细胞中分离纯化，便于重组操作 ⑤ 具有合适的筛选标记 ⑥ 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性 （可转移性） 质粒DNA的空间构型 ? SC构型:两条核苷酸链均保持着完整的环形 结构，DNA呈现超螺旋。 ? OC构型:两条链中只有一条保持着完整的环 形结构，另一条链出现缺口，称之 为开环DNA。 ? L 构型: DNA双链均发生断裂而形成线性分 子。 1.1 质粒的生物学基本特性 1. 自主复制性 携带有自己的复制起始区（ori），它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。 2. 生物不相容性（ Incompatibility ） 有时不同的质粒可同时共存在于一个细菌内，但 同群质粒（不同的，但亲缘性高）不能共存于同 一细胞，这种现象称为质粒的不相容性。 同群质粒含有相似复制子结构的不同质粒。 以大肠杆菌的质粒为例： ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容 质粒的不相容性分子机制 两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。 两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。 3.可转移性 部分质粒含有tra基因，指令宿主细胞产生菌毛，合成细胞表面物质，促使宿主细胞与受体细胞接合，导致遗传物质从一细胞转移至另一细胞中。 4.稳定性 质粒在宿主细胞中保持着一定的拷贝数。 5.寄生性 质粒只能在宿主的细胞内复制。 6.可扩增性 7. 携带特殊的遗传标记 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括： 物质抗性：重金属离子、毒性阴离子、有机物 物质合成：抗生素、细菌毒素、有机碱等。 这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。 1.3 质粒的命名 用小写字母p代表质粒，在p字母后面用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称。后面的数字是构建质粒的编号。 如：pUC18和pBR322。 1.4质粒载体的构建 加入合适的选择标记基因，通常是抗生素基因。 增加或减少合适的酶切位点，便于重组。 缩短长度，切去不必要的片段，增加装载量。 改变复制子，由严紧变为松弛型，以增加拷贝数。 加装特殊的基因元件。 目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的： pSC101 8.8 kb 拷贝数 5 四环素抗性标记基因 Tcr ColE1 6.5 kb 拷贝数 20 - 30 大肠杆菌内毒素标记基因 E1 RSF2124 ColE1衍生质粒 氨苄青霉素抗性标记基因 Apr 测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker 整合质粒 装有整合促进基因及整合特异序列，便于外源基因的整合。 穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子，便于基因能在两种不同的受体细胞中复制。 探针质粒 筛选克隆或寻找基因元件。 如何阅读质粒图谱 1.首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 2.再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。（1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。（2）Tetr 可以阻止四环素进入细胞。（3）Camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失 去毒性。（4）neor（Kanr） 氨基糖苷磷酸转移酶使G418 （卡那霉素衍生物）失活（5）Hygr 使潮霉素β失活。 如何阅读质粒图谱 3.看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 4.再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不