环境微生物教材2009简.doc

环　境　微　生　物　学　实　验 武汉大学 目 录 实验一 实验室的基本操作技能及准备工作 实验二 微生物革兰氏染色法 实验三 细菌芽孢染色法 实验四 细菌鞭毛染色法及活细菌运动性观察 实验五 培养基的制备及灭菌 实验六 生态环境中微生物检测与分离 实验七 外来化学物质对微生物的影响 实验八 土壤中微生物分离、计数与观察 实验九 表面活性剂降解菌的富集、分离及降解能力的测定 实验十 水体总大肠菌群的测定及其污染程度的评价 实验十一 水体生化需氧量（BOD5）的测定及其富营养化的评价 实验十二 武汉市江河、湖泊水体粪便污染研究 实验一 实验室的基本操作技能及准备工作 一、实验目的 1．了解微生物学实验的基本准备工作 2．明确实验目的和实验室的规则 二、实验原理及说明 实验室的准备工作都是很经典的微生物实验前准备工作，随着科学技术进步和实验条件的改善，很多手工准备的材料的准备工作都可以省去，但经典的手工准备工作在某些条件下仍有不可替代的作用，如做棉塞、包液管和包培养皿等。 三、实验材料及用品 棉花、棉线、纱布、剪刀、试管、移液管、培养皿、三角锥瓶、回型针、报纸 四、实验步骤 1．做棉塞 棉塞的作用有二：一是防止杂菌污染，二是保证通气良好。因此，棉塞做得优劣对实验的结果有很大的影响，正确的棉塞要求形状、大小、松紧与试管口或三角烧瓶口完全适合，过紧则防碍空气流通，操作不便 ，过松则达不到滤菌的目的。棉塞做好后，塞在试管或三角烧瓶上时，棉塞长度的1/3在三角瓶口处，2/3在三角瓶口之内。 2．包吸管 取干燥的移液管，在粗头端用回型针塞一小段约1.5cm长棉花， 棉花松紧适当（过紧，吹吸液太费力，过松，吹气时棉花会下滑），用火将移液管口外多余的棉花烧掉，取一张长报纸条，将移液管尖端斜放报纸条近左端，呈45o角，并将左端多余部分折在移液管上（增加尖端硬度），将移液管向前卷动，至致移液管全被报纸条包住，将右端多余的报纸条打一小结即可在吸管的上端扎一结。 3．包培养皿 将6套皿5套顺一个方向放着，（底皿向上，盖皿在下）另一皿向相反的方向6皿叠放在一起。取8开的纸一张，将6皿横放在纸的一端中间，用手顶着培养皿两端，把纸翻卷在培养皿上，慢慢向前滚动，最后包扎卷纸的两头。培养皿在卷简中不能晃动为佳。 4．熟悉实验室有关的仪器设备。 五、作业 1．撰写实验报告 2．简述实验室准备工作的要点 实验二 革兰氏染色法 一、实验要求 了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。 二、实验原理 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Christain Gram创立的。革兰氏染色法(Gram staim)不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色(复染颜色)的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液(番红)的颜色，因此呈现红色。 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料(basic dye)初染液；媒染剂(mordant)；脱色剂(decoloriSing agent)和复染液(counterstain)。碱性染料初染液的作用如在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰染色液一般是结晶紫（crystal violet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘(iodine)是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95%的酒精(ethanol)。复染料液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红染色液。 三、实验材料及用品 1．器材 显微镜、酒精灯、接种环、载玻片、染色缸 2．材料 大肠杆菌、枯草芽孢杆菌 3．试剂 革兰氏(Gram)染色液 (1) 草酸铵结晶紫染液 A液：结晶紫(crystal violet) 　　　　2g 95%酒精 　　　　20ml B液：草酸铵(ammonium oxalate)