免疫PPT第14 免疫学技术与方法.ppt

第十三章免 疫 学 技 术与方法 第一节 抗原抗体反应的特点及影响因素 是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应，是免疫球蛋白分子上的抗原结合部位与抗原分子上的抗原决定簇相互吸引以及多种分子间的引力参与下的反应。 体内反应(不同免疫应答的效应作用) 体外反应 （抗原抗体结合反应，多样性） 抗体主要存在于血清中，在抗原或抗体的检测中多采用血清做试验，所以体外的抗原抗体反应又称血清学反应。 一、抗原抗体反应的原理 抗原与抗体能够特异性结合是基于两个分子间的结构互补性与亲和性，这两种特性是由抗原抗体分子的一级结构决定的。 蛋白质 同种电荷、水化层 亲水胶体→疏水胶体 三、抗原抗体反应的影响因素 电解质 Nacl 酸碱度 pH6～8 温度 37℃ 指与细胞免疫有关的各种检测技术，包括对免疫细胞、细胞因子的检测及功能分析。 指制备与免疫检测有关的各种试剂，包括抗原制备、抗体制备及抗体标记等技术。 液相（液体） 免疫扩散 固相（凝胶） 免疫电泳 免疫荧光法是现代生物学和医学中广泛应用的方法之一，具有抗原抗体反应的特异性，染色技术的快速性，在细胞或组织上定位的准确性，以及荧光效应的灵敏性等优势。但是，由于免疫荧光法必须具有荧光显微镜，荧光强度随时间的延长而逐渐消退，结果不易长期保存等缺点，在普及应用上受到一定限制，而逐渐被免疫酶法所取代。  （一）基本原理与类型 酶联免疫吸附试验是一种固相免疫测定技术，先将抗体或抗原包被到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。测定时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应，后加入酶标抗体与免疫复合物结合，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离的未结合成分，最后加入酶反应底物，根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度(A)值的大小进行定性或定量分析的方法。　　根据检测目的和操作步骤不同，有双抗体夹心法、间接法、竞争法三种类型的常用方法。 酶联免疫吸附试验原理 （三） 间接ELISA 是测定抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本(含相应抗体)与之结合。洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体(酶标抗抗体)和底物进行测定。　　操作步骤：①包被固相载体: 用已知抗原包被固相载体；②加待检标本: 经过温育(37℃2h)，使相应抗体与固相抗原结合。洗涤，除去无关的物质；③加酶标抗抗体: 再次温育(37℃2h)与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去未结合的酶标抗抗体；④加底物显色: 终止反应后，目测定性或用酶标仪测光密度值定量测定。 第六节 免疫细胞技术 主要用于评价机体的细胞免疫功能，包括免疫细胞数量、T细胞亚群、免疫细胞活性、细胞因子检测技术。 常见的试验有：玫瑰花环试验（T、B）、溶血空斑试验（B）、淋巴细胞转化试验等。 一、淋巴细胞转化试验 形态学检测法 细胞体积增大，形态不规则，胞质增多等 3H-TdR掺入法 增殖过程中，DNA/RNA合成明显增加 ----MTT法(噻唑盐) 操作简便，无放射性污染 （一）MTT法原理 活细胞内线粒体脱氢酶能将噻唑盐（MTT）由黄色转变为蓝紫色的甲臜，甲臜的形成量与细胞增殖程度有关，与活细胞数成正比。甲臜溶于有机溶剂（DMSO、乙醇等）后，可在560nm波长下用酶标仪检测。 MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。 小鼠 培养液 1640 ConA（2.5、5、10μg/ml) MTT（5mg/ml) 二甲基亚砜（DMSO) （三）实验步骤 １、颈椎脱臼法处死小白鼠，迅速取脾脏。 ２、将脾脏放入适量生理盐水中，除去筋膜。 ３、取脾脏，用玻片研磨制成细胞悬液。 4 、细胞计数，取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20μl，加到盛有980μl计数液的EP管中，在显微镜下计数。 5、细胞培养 将细胞板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于37℃ 5%C02培养箱中，培养48小时。 6、MTT掺入 在终止培养前2小时，在显微镜下观察细胞转化情况。 每孔内加入MTT（5mg/ml) 10μl，加完后轻轻震动，使MTT和细胞混匀。 在培养箱中继续培养2小时，然后离心2000rpm，5min，轻轻弃去上清，（注意不要将孔底部的颗粒物弃出）。 加入100μl 二甲基亚砜（DMSO)，将