淋巴细胞表面抗原检测20141113硕士班课件.ppt

* 单抗对细胞的反应性 CD45表达于所有白细胞; CD3表达于T淋巴细胞; CD4表达于T辅助/诱导淋巴细胞(CD4+T细胞)和单核细胞; CD8表达于细胞毒T细胞(CD8- T)和NK细胞; CD19表达于B淋巴细胞; CD16表达于NK细胞、单核巨噬细胞、粒细胞和树突状细胞等; CD56表达于NK细胞和细胞毒T细胞。 单抗对淋巴细胞亚群的鉴定 CD4、CD8、CD16和CD56单抗均不能特异性标记淋巴细胞某一亚群。 采用CD45和(或)CD3作为设门抗体,同时兼做质控试剂。 CD3+ T细胞标记为CD3 +, CD4+T细胞标记为CD3 + CD4+ CD8+ T细胞标记为CD3+ CD8+ B细胞标记为CD3 -CD19 + NK细胞标记为CD3 - CD56+ 或 CD3 ˉ CD(16+56)+ * 直标抗体常用荧光染料 异硫氰酸荧光素(FITC) 藻红蛋白(PE/RD1) 藻红蛋白偶联物(PECY5) 多甲藻叶绿素蛋白(PerCP) 藻红蛋白-德州红偶联物(ECD) 别藻青蛋白(APC) 除别藻青蛋白(APC)外,其他荧光染料均采用488nm的激发光源激发,最大发射波长分别为525nm、575nm、670nm、675nm和613nm。 别藻青蛋白(APC)的激发光源为630nm,最大发射波长为660nm。 * 溶血素 使用与仪器相匹配的溶血素(内含固定液),并严格按照使用说明和注意事项进行操作。如果使用没有固定作用的溶血剂(如氯化铵和低渗缓冲液等),染色后标本需要保存在4℃ ,并在1h内完成上机 固定液 0.1%-2.0%多聚甲醛或甲醛缓冲液是常用的固定液,用于对感染的标本在分析前进行灭活,能够灭活HIV 等病毒的3个-5个对数级的病毒载量。在染色过程中的最后一次离心后,用含有多聚甲醛或甲醛缓冲液(Ph7.0-7.4)处理,4℃ 保存待测。 * * 流式细胞分析仪 1973年BD公司与Stanford University合作开发世界上第一台商用流式细胞仪FACSI。1980年北京师范大学引进中国第一台流式细胞仪FACSIII。 实验应用? 流式细胞仪主要有两个最基本的用途： 可以定量分析鉴定活细胞表面表达的特异分子， 进行特定的活细胞群的分离和纯化。 * 免疫细胞群的分类? ?静止淋巴细胞之间从其外观形态难以区分，都是以致密的核及少量细胞质组成的小而圆的细胞为特征。然而，这些细胞确是由功能各异的不同细胞亚群所组成，各种细胞群表达各自特殊的表面分子。 B淋巴细胞上表达有特异的膜表面免疫球蛋白（mIg），而成熟的T淋巴细胞表面表达特异的CD3分子。 T淋巴细胞又可进一步按其表达的不同表面标志细分成不同的亚群，如CD4+CD8-和CD4-CD8+亚群。因此，可由这些特征性的表面标志，将细胞分为不同的群或亚群。 * 免疫细胞的分化发育?? 免疫细胞分化发育的不同阶段，其表面标志也在不断地发生着变化。 如胸腺细胞（发育过程中的T淋巴细胞），在发育的不同阶段从不成熟到成熟，其表面标志经历了从双阴性（CD4-CD8-）到双阳性（CD4-CD8-），直到单阳性（CD4+CD8-或CD4-CD8+）的过程。正常生理状态下，发育不同阶段的胸腺细胞以一定的比例存在于胸腺中。通过检测这些标志，即可判定某些因素（基因突变等）对胸腺细胞发育的影响。 * ?免疫细胞的分子表达?? 免疫细胞的不同因素的影响下，其表达的分子也会发生变化。通过检测这些分子的变化，可分析细胞功能以及细胞分化状态等。 静止的T淋巴细胞不表达或低水平表达CD69分子；而一经活化，其表达CD69分子数量明显增加。 可通过检测这些活化标志的变化来判定细胞状态以及研究影响细胞活化状态的因素。 * 器材 10ml 圆底试管，FACs专用离心管，滴管，吸管 血球记数板，盖玻片 4℃冰箱，离心机，流式细胞仪 试剂 抗凝全血、淋巴细胞分离液 荧光素标记抗体 FACs缓冲液 Hanks液 * 操作步骤 抗凝全血2ml，加Hanks液2ml稀释。 取淋巴细胞分离液2ml置10ml试管，用滴管将稀释全血沿管壁徐徐铺于分离液界面上。 于水平式离心机中离心2000rpm，20分钟。 用滴管吸取界面白色细胞层，移入尖底离心管中。 加入足量Hanks液，充分混匀后离心1000rpm，10分钟，离心后弃上清液，将试管底部细胞充分叩匀，再用Hanks液洗涤1遍。 加1ml Hanks液重悬浮细胞，计数后取1×106细胞至FACs专用试管，离