分子医学技能PCR术及应用.ppt

PCR-RFLP法：(PCR产物限制性酶切片断多态性分析) Ras癌基因 限制性内切酶 PCR技术应用于临床检测 突变 限制性内切酶 正常 突变 电泳 法医学物证鉴定 个体识别；亲子鉴定 方法：PCR-RFLP（限制片段长度多态性） DNA指纹 PCR-ASO （等位基因特异性寡核苷酸） PCR-VNTR（可变数目串联重复序列）多态性 PCR-STR（短串联重复序列）多态性 PCR-SSCP（单链构象多态性） 线粒体DNA测序 PCR技术应用于法医学鉴定 性别鉴定 女性 男性 Y引物 PCR 男性 女性 PCR-STR(short tandem repeat)多态性检测 PCR；电泳检测 PCR技术应用于法医学鉴定 现场血迹 嫌疑人1 嫌疑人2 嫌疑人3 个体识别 PCR技术应用于法医学鉴定 父’ 父 子 母 亲子鉴定 PCR技术应用于法医学鉴定 小 结 掌握PCR技术的原理及基本步骤 熟悉PCR技术的广泛应用 参考书目 未 结 束 语 神奇且具革命性意义 予精妙于简单 启发：勤于思考、勇于创新 Thank you DMD：人类肌营养不良基因 A：无外显子8,12,17,19对应条带,说明病人外显子8～19缺失 B：病人A中未扩增外显子带的强度为C的一半,提示为区域缺失携带者 C：正常人DMD基因外显子的一般扩增形式 多重PCR检测DMD基因缺失 4. LP-PCR（Labelled primers) 利用同位素、荧光素等对ＰＣＲ引物进行标记,用以直观地检测目的基因。 特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分 病毒1 病毒2 病毒 3 病毒4 标记引物 ＰＣＲ 观察 PCR产物 5. 锚定PCR（anchored PCR, A-PCR） PCR的局限：需了解靶基因片段两侧的序列 对于未知序列怎么办？ cDNA 末端核酸转移酶 3’GG…GG 5’ CC…CC 锚定引物 3’GG…GG 5’ CC…CC 3’GG…GG CC…CC 锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对的3’锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增 6. PCR固相分析法 模板 生物素化引物 PCR扩增 探针 亲和固相介质 检测探针信号 可用于基因芯片的制作 7. 原位ＰＣＲ 原位聚合酶链式反应（In Still PCR,Is－PCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位。 适用于检测病理切片中含量较少的靶序列 既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH）,但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下,该方法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列,敏感度很高,但却未能与细胞形态学研究相结合。 ISPCR则可把这两者结合起来,成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。 原位PCR的作用 操作步骤 1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入 2. PCR扩增细胞内目的片段 3. 原位杂交检测扩增产物 A.阳性对照 B.阴性对照 C.原位检测mRNA表达 8. ＲＴ－ＰＣＲ 逆转录酶 ＤＮＡ聚合酶 mRNA cDNA 杂化双链 PCR扩增 基因 mRNA 蛋白质多肽链 琼脂糖凝胶电泳 荧光定量 PCR 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。 荧光定量 PCR仪 荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪,通常配有电脑系统及相应的分析软件。 9. 荧光定量ＰＣＲ 荧光定量PCR标记方法 内掺式染料 SYBR Green I 序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET) 引物特异性探针 Amplifluor (Intergen) 5’ 3’ 5’ 3’ SG Excitation SG SG SG SG Emiss