现代组织化学1.化课切片制作刘秀萍.ppt

* 预实验：摸索最佳固定和切片方案。 例：肝组织AFP免疫组化染色 丙酮-甲醛固定为首选 石油醚透明石蜡包埋 较好保存AFP的抗原性，阳性染色强，几乎没有背景染色; 其次：PLP固定液 苦味酸-多聚甲醛固定液。 * 丙酮-甲醛 PLP 苦味酸-多聚甲醛 95%乙醇 * 三、脱水(dehydration)：用不同浓度的脱水剂 (常用酒精)逐步把组织中的水分置换出来，该过程---组织脱水 ? 脱水目的： 水不能与石蜡混合，石蜡包埋前必须脱去组织中水分。 常用脱水剂: 酒精、丙酮、正丁醇、叔丁醇、环己酮等 最常用酒精，因其脱水能力强、可与水按不同比例混合、与透明剂二甲苯互溶。 * 脱水注意事项: 由低到高浓度。多从70%酒精开始。 如组织含水多，则从更低的浓度开始(如30～40%的酒精)。以防止组织收缩过快变脆。 脱水时间要适当：据组织块大小、厚薄及组织的不同适当调整。 时间短：脱水不彻底，透明及浸蜡受影响，切片难切，质量差， 染色效果也差； 时间过长：组织会收缩变硬变脆。 适当时间：各级酒精〈12h，无水酒精〈4h。 不能进行下去，标本退回至80%酒精保存。 （脂肪组织、疏松的纤维组织适当增加脱水时间； 胃粘膜、支气管粘膜活检组织应适当缩短脱水时间） 3. 最后两次无水酒精必须保持无水（保证脱水彻底），酒精定时更换，一般两周更换一次；在无水酒精中放置无水硫酸铜吸水。 * 脱水的步骤和时间： 如1.8cm X 1.8 cm , 厚0.2～0.3 cm的组织块，按下步骤和时间脱水: 70%酒精 1～2 h 80% 酒精 2～4 h 90%酒精 2～4 h 95% 酒精 2～4 h 无水酒精1 2～4 h 无水酒精2 2～4 h * 免疫 组织化学染色 70% 酒精 4℃冰箱 2～4 h或过夜 80% 酒精 4℃冰箱 2～4 h 90% 酒精 4℃冰箱 2～3 h 95% 酒精 1 4℃冰箱 1～2 h 95% 酒精 2 4℃冰箱 1～2 h 无水酒精 1 4℃冰箱 1 h 无水酒精 2 4℃冰箱 1 h 二甲苯1 4℃冰箱 1 h 二甲苯2 4℃冰箱 0.5 h 石蜡1 60℃ 1 h 石蜡2 60℃ 2 h * 为缩短固定、脱水、包埋的时间，尽可能保存组织的抗原性，提高免疫组化染色的阳性结果， 组织块应尽量修得小一些、薄一些，使组织能在较短的时间内充分地完成固定、脱水、透明和浸蜡。 * 四. 包埋(embedding) 目的：使组织块保持一定的形状和硬度，以便在切片机上切成薄片。 方法：石蜡包埋和冷冻包埋两种方法。 （一）石蜡包埋：包埋时要观察面朝下。 （脱水）---透明、浸蜡、包埋： 透明：组织脱水后，因为酒精等脱水剂不能溶解石蜡，所以在浸 蜡前需要一个既能与酒精混合又能溶解石蜡的媒剂进行处 理，以便能使石蜡渗入到组织中。由于所用媒剂的折光率 与组织蛋白质的折光率相近，可使组织透明，因此把这一 过程称之～ 。(二甲苯) * （二）冷冻包埋 冷冻包埋能较好保存抗原，新鲜及已固定材料均适合冷冻包埋、切片。 目的：减少组织中的水分以减少冰结晶的产生； 方法：已固定、冲洗的组织块放入20～30%蔗糖缓冲液内，4℃冰箱过夜，再将组织块埋于OCT包埋剂或甲基纤维素内，以备速冻；但实际操作时可不一定经过蔗