免疫学前沿免疫学测硕士激光共聚焦.ppt

3.2 免疫细胞功能测定 * 细胞增殖试验 细胞毒试验 吞噬功能测定 细胞因子检测 抗体形成细胞测定 皮肤试验 体外实验 体内实验 细胞增殖试验 * 形态计数法：淋巴细胞转化实验 3H-TdR或125I-UdR掺入法 MTT比色法 BrdU或EdU掺入结合FACS测增殖 CFSE标记测细胞分裂 MTT比色法 * MTT，(四唑盐，商品名为噻唑蓝)可溶性盐，掺入细胞 细胞增殖，MTT形成紫褐颗粒 异丙醇溶解为蓝紫色 测OD值 简便，无污染 BrdU掺入结合FACS测增殖 * BrdU(5’-溴脱氧尿苷)可在细胞合成DNA时替代胸腺嘧啶（T），后通过加入荧光标记的抗BrdU抗体，利用流式细胞仪检测BrdU掺入率，从而反映细胞增殖水平 CFSE标记测细胞分裂 * 3 day 6 day 2-羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE或CFDA-SE)可穿过细胞膜、不可逆地与胞内蛋白和膜表面蛋白结合的荧光染料。 当细胞分裂时, CFSE标记荧光可平均分配至2个子代细胞中，因此，CFSE含量减少的细胞代表增殖的子代细胞。 细胞毒试验 * 51Cr释放法：γ计数仪 乳酸脱氢酶（LDH）释放法：光度计测定 细胞染色法：台盼蓝染色 凋亡细胞检测法 形态学 琼脂糖凝胶电泳法：梯状DNA区带图谱 FACS：亚二倍体峰；PI/Annexin-V TUNEL法：敏感，早期凋亡 FACS：多种方式检测凋亡 * DNA分析-亚二倍体峰 细胞膜分析-PS外翻 酶学分析-Caspase-3 细胞因子检测 * 生物学检测法 免疫学检测法 分子生物学检测法 免疫学检测法 * ELISA ELISPOT ICS(Intracellular cytokine staining) CBA(Cytometric Bead Array,微量样本多指标流式蛋白检测技术) ELISPOT 原理 Ab包被培养孔 加入淋巴细胞及培养液 细胞分泌的细胞因子与Ab结合 ELISPOT ELISPOT 原理 加入酶底物显色形成斑点 洗除细胞，加入生物素标记的抗细胞因子抗体及酶标抗生物素抗体 结果观察 ICS * 细胞因子跨膜分泌阻滞剂 破膜剂使荧光抗体可以进入细胞内 流式细胞记数技术可以记数细胞 WB(Western blotting,免疫印迹) IH (Immunohistochemistry,免疫组织化学) IF (immunofluorescence,免疫荧光技术) IEM(Immune lectron microscopy,免疫电镜) FCM(Flow Cytometry,流式细胞术) ELISA(enzyme linked immunosorbent assey,酶联免疫吸附实验) 将含有目标蛋白(抗原)的样品首先用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)或非变性电泳(Native)等分离后，通过转移电泳原位转印至硝酸纤维素膜或其它膜的表面， SDS PAGE:在缓冲液中添加 SDS 的电泳系统称为 SDS(十二烷基硫酸钠〔皮肤清洁药〕) 胶片电泳 (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis 简称 SDS). SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质结合固定比例之 SDS 後,由於 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量之蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白质的泳动速率就只剩下分子大小一项因素 然后用蛋白溶液（如10％的BSA）处理以封闭硝酸纤维素膜上剩余的疏水结合位点，而后用所要研究的蛋白质的抗血清（一抗）处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗结合，而其它蛋白质不与一抗结合。 处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合，可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。 印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶催化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质的位置。 然后将膜表面的蛋白质再用抗原抗体反应进行特异性检测。例如，将经SDS分离的蛋白质带转移到膜上后，膜用封闭液处理，然后与第一抗体反应，膜经漂洗后再与偶有辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸(酯)酶(AP)的第二抗体反应，加人生色底物反应之后，即可显示出目标蛋白的位置。  * * 间接凝集反应 将可溶性抗原吸附或耦联在