核苷酸类物质课件.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * Mn2+限量与生物素亚适量结果相同，但机制不同。 Mn2+亚适量：培养后期，细胞形态异常（伸长、膨胀、不规则） 生物素亚适量：为乙酰CoA羧化酶的辅基，影响脂肪酸生物合成，间接影响细胞膜磷脂合成，从而影响细胞膜透性。 2.培养条件 （1）因所用菌株为腺嘌呤缺陷型，所以添加适量腺嘌呤（加0.5%酵母膏或酵母水解液）。 （2）Mn2+亚适量 工业原料和工业用水含较多的Mn2+，难于控制Mn2+亚适量,有两条途径： a.筛选对Mn2+不敏感的突变株 b.加抗生素或表面活性剂以解除过量Mn2+的影响。 （3）添加较高浓度的磷盐。 （二）二步法（肌苷酸生产主要方法） 发酵法 肌苷 肌苷酸 原因： IMP对细胞膜的透性很差。 微生物中普遍存在使IMP脱磷酸化的酶类。 磷酸化 肌苷生产菌的选育 常用：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的腺嘌呤缺陷型。 原因： 该菌磷酸酯酶活性强，有利于将IMP脱磷酸化形成肌苷，分泌至胞外，而产氨短杆菌的磷酸酯酶活性较弱。 因此，对B. subtilis 进行菌种改良，可大量积累肌苷。 2.培养条件 （1）培养基： 碳源：淀粉水解糖或糖蜜 氮源：要充分（因肌苷含氮量高，20.9％） 无机盐：可溶性磷盐有抑制作用（胞外磷酸化） 生长因子：加适量含腺嘌呤的物质，如酵母膏。 腺嘌呤的最适浓度： 不影响菌体生长 使肌苷大量积累 （2）发酵条件 通气搅拌：供氧充足，促进肌苷生成，并可减少CO2对肌苷生成的抑制。 （3）肌苷的提取 先过阳离子交换柱，再过活性炭柱（吸附），结晶。 3.肌苷的磷酸化 （1）酶法： 酶：核苷磷酸化酶（三叶草假单胞菌） 磷酸的供体：对硝基苯磷酸 难点：除5 ? －磷酸化产物外，还有3 ? -、2 ? -位异构体，收率85％。 （2）化学法：用不同的磷酸化试剂。 4.肌苷酸的提取 离子交换法 除菌体 除对硝基酚 柱层析 （过滤、离心） 活性炭吸附 加乙醇沉淀 精制（结晶） 粗制品 肌苷酸 四、鸟苷酸的生产 鸟苷酸由鸟嘌呤、核糖和磷酸三部分组成。 1960年，日本科学家发现5‘－鸟苷酸钠具有强烈的鲜味。1961年又证实了香味极浓的著名菇类－香菇含有大量的鸟苷酸，从此开始研究GMP的生产方法。 鸟苷酸的生产方法： （1）由酵母细胞提取出核酸，再以酶法降解； （2）直接发酵法生产鸟苷酸； （3）以化学法磷酸化发酵生产的鸟苷； （4）双菌混合发酵法。利用5 ?一黄苷酸或黄苷酸生产菌与能将黄苷酸或黄苷转化为鸟苷酸的菌株混合培养。 （一）二步法 （常用） 1.选用二步法的原因： （1）GMP的细胞膜透性很差（限Mn2+） 微生物中普遍存在鸟苷酸的降解酶系（加高浓度磷盐）,培养条件较复杂。 （2）直接发酵法产酸率不高，因GMP是嘌呤核苷酸生物合成的终产物，使鸟苷酸的自身合成受阻。 （3）鸟苷的溶解度低，容易析出，相对减弱了反馈调节的强度，使积累鸟苷成为可能。 2.鸟苷生产菌的选育（鸟苷高产菌株应具备的条件） （1）丧失腺苷酸琥珀酸合成酶活性，即切断肌苷酸到腺 苷酸的通路。 （2）鸟苷分解酶的活性微弱。 （3）解除鸟苷酸的反馈抑制与阻遏。 （4）由肌苷酸脱氢酶、鸟苷酸合成酶催化的反应，比核 苷酸酶催化的反应优先进行，从而抑制肌苷的产生。 按上述要求，利用枯草芽孢杆菌腺嘌呤缺陷型加以诱变获得。 3.鸟苷发酵条件 （1）培养基 碳源：葡萄糖或麦芽糖 氮源：硫酸铵（氯化铵、大豆蛋白水 解液）、流加氨水 无机盐：磷、镁、铁、锰 嘌呤前体物：L-谷氨酸钠 营养缺陷型菌株的营养物质 （2）发酵条件 温度：36℃（0~24h） 36.5~37.5 ℃ （24h后） pH值：pH值下降，流加氨水。 溶氧： 发酵周期：48h左右 （3）鸟苷的分离提取 灭菌后发酵液→除菌体→一次结晶→过滤→鸟苷粗品→脱色→过滤→二次结晶→过滤→鸟苷 →烘干→磨粉→ 包装 （二）酶法（又称核酸水解法） 起始于日本，50－60年代研制成功，技术关键是筛选到