生物化学验课件生物化学实验42010.7.6.ppt

生物科学与工程系生物化学教研室 思考题： 什么叫电泳？ 用醋酸纤维薄膜电泳做电泳支持物有什么优点？ 电泳图谱清晰的关键是什么？如何正确操作？ 实验四 血清蛋白的醋酸纤维素薄膜电泳 实验目的 1.掌握电泳法分离蛋白质的原理、操作方法。 2.了解电泳法分离蛋白质的临床意义。 分离蛋白质的方法 电泳 离子交换层析 分离方法 分子大小 溶解度 透析和超滤 密度梯度离心 凝胶过滤 等电点沉淀 盐析 有机溶剂分级分离 对配体的特异生物学亲和力 电荷 吸附性质 吸附层析 亲和层析 实验原理 电泳:带电质点在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。 电泳原理：在一定pH条件下，不同的质点由于等电点不同而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此可使它们分离。 影响电泳迁移率的因素： 外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象。 内在因素：质点所带净电荷的量、质点的大小和形状。 （一）电 泳 技 术 （一）按支持物的物理性状不同，区带电泳可分为： 1．滤纸电泳和薄膜电泳(如醋酸纤维素薄膜电泳和聚酰胺 薄膜电泳)； 2．粉末电泳：如纤维素粉、淀粉电泳； 3．凝胶电泳：如琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳，分辨率高； 4．丝线电泳：尼龙丝、人造丝电泳。属于微量电泳。 区带电泳的分类 （二）按支持物的装置形式不同，区带电泳可分为： 1．平板式电泳：支持物水平放置； 2．垂直板式电泳：聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳； 3．垂直柱式电泳：聚丙烯酰胺盘状电泳 (三)按pH 的连续性不同，区带电泳可分为： 1．连续pH电泳：即整个电泳过程pH 保持不变，如常用的纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳等。 2．非连续pH电泳：缓冲液和电泳支持物间有不同的pH 的电泳，如聚丙烯酰胺凝胶盘状电脉，等电聚焦电泳等。 （二）血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 醋酸纤维素薄膜： 醋酸纤维素（二乙酸纤维素）薄膜具有均一的泡沫状结构，厚度约为120?m，渗透性强，对分子移动无阻力，用它作区带电泳的支持物，具有用样量少，分离清晰，无吸附作用。目前可用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。 　　醋酸纤维素薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点。 蛋白质名称 等电点（pI） 相对分子质量/Mr 清蛋白 α1－球蛋白 α2－球蛋白 β－球蛋白 γ－球蛋白 4.80 5.06 5.06 5.12 6.85~7.5 69000 200000 300000 90000~150000 156000~300000 血清中几种主要蛋白组分 缓冲液pH=8.6 pI＜pH 血清蛋白带负电荷,在电场中向正极移动 本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白。血清中含有清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组成、分子量、等电点及形状不同，在电场中的迁移速度不同。以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。 血清蛋白依次分为清蛋白， 球蛋白的α1、α2、β、γ五个区带 请预测血清蛋白电泳区带图 清蛋白 α1 γ α2 β 实验器材及试剂 一、器材： 醋酸纤维素薄膜（2cm×8cm）、培养皿、滤纸、无齿镊、剪子、加样器（可用盖玻片或X胶片或微量加样器）、直尺、铅笔、玻璃板（8cm×12cm）、烧杯、试管、试管架、吸管、电泳仪、电泳槽。 二、试剂 1、巴比妥缓冲液(pH8.6，0.07mol/L，离子强度0.06)：称取巴比妥钠12.76g、巴比妥1.66g，加500毫升蒸馏水，加热溶解。待冷至室温后，再加蒸馏水至1000毫升。 2、氨基黑10B染色液：称取氨基黑10B?0.5g加入冰醋酸10ml、甲醇50ml,混匀，加蒸馏水至100ml。 3、漂洗液:甲醇45ml、冰醋酸5ml，混匀后加蒸馏水至100ml。? 实验步骤 1.?准备 将缓冲液加入电泳槽的两槽内，并使两侧的液面等高。裁剪尺寸合适的滤纸条，叠成四层贴在电泳槽的两侧支架上，一端与支架前沿对齐，另一端侵入电泳槽的缓冲液内，使滤纸全部湿润，此即?“滤纸桥” 。 1：滤纸桥 2：电极缓冲液 3：醋酸纤维素薄膜 将醋酸纤维素薄膜切成2cm×8cm大小，在无光泽面的一端约1.5cm处，用铅笔轻划一直线，作为点样位置。然后将无光泽面向上，做好标记，置于盛有巴比妥缓冲液的培养皿中浸泡，待充分浸透（约40min）即无白色斑点后取出，用洁净滤纸轻轻吸去表面的