分子医学技能04质粒DNA的提与酶切.ppt

* 质粒DNA的提取与酶切 实验四 袁洁 2015.10 今天实验分2个部分： 质粒DNA提取 质粒的酶切 （电泳检测下次进行） 一、实验原理 质粒——质粒是存在于细菌体内的一类 独立于染色体的自主复制的遗传成分，在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。 质粒 (plasmid) 质粒是存在于细菌体内的一类 独立于染色体的自主复制的遗传成分，在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。 ???? 质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子。有一些质粒能携带外源DNA，可以作为目的基因进入受体细胞的运载工具。 2.目的基因 和质粒载体 的连接 3.将重组DNA分子导入受体细胞 4.选择 5.目的基因表达 1.目的基因的获取 DNA片段（目的基因）与载体DNA分子相连接，形成重组DNA 选出含有所需要的重组体DNA分子的受体细胞 目的基因在受体细胞中高效表达，合成产物（蛋白质) 重组DNA技术的一般过程 基因克隆示意图 宿主基因组 大肠杆菌 + 重组质粒 质粒载体及其拷贝数 质粒 复制子 拷贝数 pBR322 及其衍生质粒 pMB1 15～20 pUC 系列质粒及其衍生质粒 突变的pMB1 500～700 pACYC 及其衍生质粒 p15A 10～212 pSC101 及其衍生质粒 pSC101 ～5 ColE1 ColE1 15～20 质粒DNA的一般特性? ： ①质粒是细菌内的共生型遗传因子，有相对独立性。 ②它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型 ③它是双链闭合环状DNA，分子量大小不等 质粒的三种构型： 闭合环状DNA 开环DNA——如果两条链中有一条发生一处或多处断裂，分子因旋转而消除链的张力。 线状DNA——如果两条链均断开，即为 线状DNA。 质粒DNA与宿主菌染色体DNA的区别： 宿主菌染色体DNA通常比质粒DNA要大得多 分离纯化质粒DNA 的三个主要步骤： ①培养细菌使质粒扩增（DNA的扩增与选择） ②细菌的收集与裂解 收集——高速离心的方法 ③质粒DNA的纯化 所有纯化方法都是利用了质粒DNA相对较小及共价闭合环状的性质。 碱法抽提质粒的主要溶剂 溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris?Cl组成. 葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的机械剪切作用,防止破坏质粒. EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子,防止DNA酶对质粒分子的降解作用。 Tris?Cl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围 溶液Ⅱ：SDS、NaOH SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性； NaOH的作用是破坏氢键，使DNA分子变性。 溶液Ⅲ：KAc、HAc 溶液Ⅲ能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA复性而发生缠绕并使质粒DNA复性。 SDS碱裂解法制备质粒DNA的原理： 在有EDTA、溶菌酶及SDS存在的条件下，用碱处理细菌，可以使细菌的细胞壁破裂，释放出细胞内容物（染色体DNA、蛋白质和RNA等）。 强碱环境可以使细菌线性分子染色体DNA氢键断裂，双链解开变性，而质粒DNA的超螺旋共价闭合环状的双链并不完全分离 再加入高浓度酸性盐 在有高盐存在的条件下： 线性染色体DNA凝聚成不溶性沉淀物； 变性的蛋白质与SDS和K+形成的复合物也形成沉淀； 小分子的质粒DNA却呈天然构型，能溶解在buffer中 通过离心可以把线粒体DNA、不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起除去 如果要提高DNA的纯度，则可以用RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质。 实验步骤： 加1.5ml培养物于EP管，12000rpm×30s（可重复一次） ? 去上清（除净），加入100μl 溶液I，充分重悬 ? 加入200 μl 溶液II，立即、轻柔振荡数次 ? 加入150 μl 冰溶液III，震荡10s，冰浴3~5min， 12000rpm×10min 裂解细菌、释放质粒DNA 转移上清到新EP管，加入等体积饱和酚（约450 μl） 振荡混匀，离心12000rpm×10min 转移上清到新EP管，加入等体积氯仿：异戊醇（共约450 μl） 振荡混匀，离心12000rpm×5min 除去杂质、纯化质粒DNA 转移上清到新EP管加入2倍体积乙醇（约800 μl）混匀，冰浴15min 离心12000rpm×15min 弃上清， 100 μl 70%乙醇洗沉淀，12000rpm×2min? 弃上清，静置干燥，0.1×TE 20 μl