分子生物学实验实验十 Western blozxl2014八年制 主.ppt

* 分离胶 饱和正丁醇 将0.5 ml左右水饱和的正丁醇加在分离胶液面上 * 10ml 30% 丙烯酰胺 1.32ml 4×浓缩胶缓冲液 2.5ml 10% SDS 0.1 ml 10% 过硫酸铵 50μl TEMED 5μl ddH2O 6.0 ml 4%浓缩胶溶液 弃去正丁醇，加ddH2O冲洗，倒掉ddH2O，用吸水纸吸干残留ddH2O 配置浓缩胶溶液，混匀，缓慢加入分离胶上，直至液面达到短玻璃的上缘 小心地插入梳子，注意赶走气泡 细胞总蛋白的制备 P34.四.1(1-7) * * 取1瓶HL60细胞，用滴管吹打成单细胞，转入15ml离心管。 4℃ 3000 rpm 离心5 min。弃上清。 细胞沉淀用10 ml PBS重悬，4℃ 3000 rpm 离心5 min。弃上清。 用1ml PBS重悬细胞，转入1.5ml离心管，4℃ 3000rpm 离心5 min，弃去上清，倒置于纸巾上1 min。 制备细胞总蛋白（一） * 细胞沉淀用50ml的4%SDS重悬、搅匀，沸水浴中加热10分钟。(注意要用胶布缠紧离心管盖) DNA剪切：冰浴超声（414室）约20 min，直至溶液不再粘稠。 室温10,000rpm 离心10分钟，取45ml上清液移至另一新管，加入4 ×蛋白上样缓冲液15 ml ，混匀后沸水浴中加热5分钟。(注意要用胶布缠紧离心管盖) 制备细胞总蛋白（二） * 四、实验步骤 上样电泳： 将配胶装置（电泳芯）放入电泳槽 上槽加满电泳缓冲液（液面高出短玻璃上缘）, 下槽缓冲液没过正极电极丝, 液面大约在下面的螺丝处。 向上垂直拔出梳子 * 上样 2.5cm 7cm 转膜 考马斯亮蓝染色 marker * 样品准备：15 μl蛋白样品+4×loading 5 μl ，沸水浴2min (注意要用胶布缠紧离心管盖) 预染蛋白Marker10 ml，直接上样 电压：浓缩胶：120v，分离胶：200v 待溴酚蓝泳动到凝胶下缘时停止电泳 蛋白质的考马斯亮蓝染色：P39，四10. 切下需染色的部分凝胶放入表面皿中，加入适当体积的考马氏亮蓝染液，加盖，在摇床上室温染色2小时 转膜 转移缓冲液(含15%甲醇) 量取转移缓冲液85 ml, 加入甲醇15ml。配好后共100 ml，每组50ml 封闭 结束,下周 * 四、实验步骤 * 去除浓缩胶和多余的分离胶，保留分离胶面积稍大于 2.5 ×7 cm，将其在转移缓冲液(含15%甲醇)中平衡15分钟。 PVDF膜(2.5×7cm)用甲醇预湿，浸泡入转移缓冲液2～5min。 在转移电泳槽的底板（阳极）上铺上已饱和了转移缓冲液的厚滤纸，放上PVDF 膜。 将平衡好的凝胶（稍大于PVDF 膜）小心地放在PVDF膜上，其上再放置一张湿的厚滤纸。 盖上电泳槽的盖子(阴极)，插好电源，用0.8mA/cm2的电流转移60分钟。 取下PVDF膜，用铅笔标记Marker位置，放入封闭液中，4 ℃封闭过夜 转膜： * 转膜： * 注意事项 Pre-stained Protein Ladder * 实验安排 示教 装胶槽 制分离胶 P38.上表格 讲课 制浓缩胶 P38.四.5 细胞总蛋白的制备 P34.四.1(1-6) 上样电泳 考染 转膜 P41.四.2( 封闭 P42.四.3 结束,下周 * 实验十一 Western Blot 支秀玲 zhixiuling@fudan.edu.cn 脱色：染液倒入收集废液的烧杯（在水槽中），倒入脱色液，室温缓慢摇动，直到凝胶背景无色，蛋白质条带呈清楚的蓝色为止。期间更换一次新的脱色液。 注意：废弃的染色液和脱色液都倒入水槽中的大烧杯然后再统一回收。小心蓝色的液体污染白色的瓷砖或地面。 * 电泳结果检查 * 转膜效果检测 * PVDF膜上鉴定蛋白质 * 显色系统： IgG-HRP DAB/H2O2 （辣根过氧化物酶 四氢氯化二氨基联苯胺/过氧化氢） 结果呈棕色。 反应稳定，价廉，但灵敏度低。 IgG-AKP BCIP/NBT（碱性磷酸酶 5-嗅4-氯3-吲哚磷酸盐/四唑氮盐） 结果呈蓝紫色。 反应不稳定，昂贵，但灵敏度高。 3.化学发光显色法(IgG-HRP +ECL) 注意：如果选用AP作为显色方法，封闭时就要选择Tris缓冲体系，不要用PBS，因为PBS干扰AP Ecl 显色原理： 溶液A主要成分为Luminol及特制发光增强剂 。 溶液B主要成分为H2O2及特殊稳定剂。在辣根过氧化物酶（HRP）的催化作 用下,鲁米诺与过氧化氢反应生成一种过氧化物， 过氧化物不稳定随即分解，形成一种能发光的电子激发中