分子医技能实验一 研究生 基因组DNA制备.pptx

分子生物学技术;学习要求;实验室秩序 （时间，物品保管，工作服，分组与值日） 仪器与设备的使用 实验室安全环保 ;本次实验安排;实验原理;染色体;核酸提取的主要步骤 主要包括：破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质及多糖、脂类等生物大分子，去除其它不需要的核酸分子、去除盐类、有机溶剂等杂质，纯化核酸等。;人基因组DNA的制备 实验目的及意义 1. 从人口腔上皮细胞中提取纯的基因组DNA 2. 掌握基因组DNA抽提的方法，理解核酸分离纯化的基本原理; 实验材料及试剂 材料：人口腔上皮细胞 试剂及其功能： 抽提缓冲液：Tris-Cl pH8.0 ，EDTA，NaCl， RNAase SDS，蛋白酶K， 饱和酚 氯仿/异戊醇（24:1） 75%及95%乙醇 TE缓冲液：Tris，EDTA; 基因组DNA提取原理; ? 分离纯化基因组DNA的方法有很多种： 不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同，分离方法也有差异。但原理相似，都是利用两种DNA的差异来分离的，因此它们有共同的步骤： ① 裂解细胞：SDS裂解细胞，EDTA抑制核酸酶 ② 除去蛋白质：蛋白酶K水解蛋白质，酚和氯仿/异戊醇 抽提、分离蛋白质； ③ 析出DNA：乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。 ;取材: 漱口后(去食屑)，含生理盐水10~15ml约2~3min(偶尔咀嚼)，用15ml离心管离心 ① （4000rpm 10min）收集细胞，弃上清 ? 沉淀中加入0.5ml抽提缓冲液，重悬沉淀，转移至1.5ml EP管 （微量移液器的正确使用） 混匀，65℃ 温育15min，间歇振荡 ? 加入等体积的饱和酚（注意：取下层的酚溶液），充分颠倒混匀 ② 12000rpm?5min，上层水相转移至新的EP管 （高速离心机的使用与安全：管对称平衡）? 加入等体积氯仿/异戊醇，颠倒混匀 ③ 12000rpm?5min，上层水相转移到新的EP管 ? 加入2倍体积95%的乙醇，颠倒混匀，12000rpm?5min ④ 弃上清，沉淀中加入0.5ml75%乙醇漂洗，12000rpm?2min ⑤ ? 轻轻弃去上清，打开EP盖，管平放室温静置10~15min 加入30?lTE溶液，4 ℃ 保存，便于下次实??电泳染色检测和PCR?;;分离纯化核酸总的原则： ①应保证核酸一级结构的完整性； ②排除其它分子的污染（蛋白质、脂类、糖、有机溶剂、金属离子、外源DNA、RNA等） 。 核酸纯化应达到的要求： ①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； ②其它生物大分子的污染应降低到最低程度； ③排除其它核酸分子的污染。; ① 尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 ② 减少化学因素对核酸的降解（如过量酸碱） 。 ③ 减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力（强 烈震荡、渗透压急剧改变、反复冻融）和高温 ④ 防止核酸的生物降解（核酸酶的预防） 。 ;核酸制备的步骤： ;apoB (用个人基因组DNA为模板）;关于apoB基因;;1．简要叙述酚/氯仿抽提ＤＮＡ体系后出现的现象及其成因。 沉淀ＤＮＡ时为什么要用无水乙醇？ ;微量加样枪使用程序及注意事项 ;1 每次实验课前主管技术员检查确认加样枪完好后交带教 老师签名领取。;第一步: 看整体;操作按钮;第二步: 看大小; 20 ?l;调节加样枪容量时切勿超过最大容量，否则加样枪将被损坏 ;第三步: 学调节;第四步: 学使用;第五步: 学维护