DNA Extraction DNA提取课件.ppt

Forensic DNA Extraction 张达江 Chelex-100法 原理 Chelex是一种螯合树脂，由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成。含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，能选择性螯合二价金属离子，比普通的离子交换剂具有更高的金属离子的选择性与较强的结合力，能够结合许多影响下一步分析的外源物质，通过离心出去Chelex颗粒，能够有效出去下游PCR反应的抑制剂。防止DNA降解。 优缺点 优点 快速、简便、所有反应在一管中进行，DNA损失小、避免污染。 局限性 DNA提取的浓度小，DNA纯度低，残留的杂质影响后续PCR反应；对检材的要求高。尤其对于一些被石灰，泥土，燃料污染的检材效果欠佳。 有机溶剂法 原理 利用酚氯仿等蛋白质变性剂使得细胞中的蛋白质变性，并吸附蛋白质于有机相中，而核酸则溶解于水相中，通过高速离心可以分离到核酸。 优缺点 优点 提取到的DNA纯度很高，且能获得大片段的DNA，这对于做RFLP及扩增比较长的STR基因座是一个很大的优势 劣势 提取过程烦琐，提取过程中需要更换几次离心管，容易造成污染，而且，如果酚氯仿等有机试剂除不干净，容易抑制后续的PCR反应 无机盐法提取DNA 原理 无机盐法是利用6mol/L的NaCl或者醋酸钠沉淀蛋白质代替酚氯仿抽提步骤来去除蛋白质，其他步骤同有机溶剂提取法。 优缺点 优点 同有机提取法 缺点 虽然步骤中少了酚氯仿等有机溶剂，但是很高的盐浓度很难除得干净，对于后续的PCR反应依然有抑制作用，除此之外，提取步骤也很烦琐 硅珠法 原理 在高浓度的硫酸氰胍的存在下，二氧化硅微粒能特异捕获有机质溶液中的DNA分子，而得以分离生物检材的DNA；被吸附的DNA在没有硫氰酸胍存在的情况下，又能够被释放出来，硫氰酸胍是高校的蛋白质变性剂，可以使得蛋白质与DNA分离。 优缺点 优点 提取DNA快速简便，纯度高，尤其对陈旧骨核等样本提取DNA模板得率较有机溶剂法高。 缺点 成本比较高，目前有相关的试剂盒可以出售，市场的GlassMilk就是其中一种。 磁珠法 原理 利用磁性硅珠吸附白细胞，用细胞裂解液裂解细胞，从细胞中游离出来的DNA分子能被吸附到磁性颗粒表面，蛋白质等分子不被吸附，留在溶液中。磁场作用下，磁性颗粒与液体分开，回收颗粒，再用纯水或者TE，洗脱吸附的DNA。 优缺点 优点 提取方法简单，在同一反应管中进行，没有样品的损失，不需要离心，更适合自动化提取，与Chelex法相比，纯度高，DNA得率也很高 缺点 成本相对比较高 FTA卡片法 原理 FTA卡片预先被一种专利化合物浸透，当血液与FTA卡接触后，细胞膜被裂解，蛋白质发生变性，DNA分子则被捕获并与载体牢固结合。 优缺点 优点 快捷方便，安全易长期保存 缺点 比较贵 碱裂解法 原理 直接用NaOH裂解细胞，接着用Tris-HCl中和NaOH, 离心后的上清液中就可以直接用与PCR。 优缺点 优点：简单方便，成本比较低 劣势：残留的碱，或者Na+会影响后续的PCR反应 商品化的试剂盒方法 Qiagen硅胶旋转柱法，原理同硅珠法 Dynabeads DNA direct Kit，原理同磁珠法 Glassmilk法，原理同硅珠法 针对混合样本的方法——差异裂解法 原理 利用不同细胞的生化结构差异，从而采取不同的生化手段逐一裂解提取DNA的手段，比如上皮细胞与精子细胞膜上结构有差异，具体表现在精子细胞膜与核膜含有大量的硫醇蛋白，二硫键丰富，比上皮细胞更难打开，需要DTT才能打开，故可以利用这种特性在纯化DNA前使得精子DNA与上皮细胞DNA分开。 优缺点 优点 对于性犯罪中的混合精斑DNA的分析，是一种很好的手段。 缺点 有时候不能完全分离两种样本 各种DNA提取方法的评估 评估指标 DNA产量 DNA质量 DNA纯度 提取步骤的烦琐程度与费用 总 结 每一种提取DNA的方法都有其优势与劣势，要看实际情况而有针对性的选择。 对于建库用的血样等样品，完全可以采用成本低，易操作，不易污染的Chelex法。 对于微量或者稀有检材，DNA产量、质量才是最关键的指标，成本与操作方法的简便与否次要考虑；很多情况下，为了获得最佳结果，需要几种方法联合使用。 对于技术服务人员，在实验的过程中要注意客户的DNA提取方法采取的是哪一种，在PCR过程中如果出现意外的话，可以迅速找到问题所在以及对策。 谢谢！ 欢迎指正 * * *