基于代谢组学整体表征的黄药子肝毒性研究.docVIP

　　基于代谢组学整体表征的黄药子肝毒性研究 作者：崔立然，于栋华，徐浩，刘树民 【摘要】 目的研究经黄药子染毒后大鼠尿液的代谢表型的改变及其与血浆生化指标的相关性，探讨代谢组学在中药黄药子肝毒性研究中的可行性。方法运用UPLC-Q-TOF/MS技术手段对空白组、黄药子组的大鼠7 d的尿液进行分析，建立各组大鼠的尿液代谢轮廓图，并进一步借助模式识别方法—主成分分析，从体内微观角度表征各组大鼠代谢网络的异同，来探讨代谢组学在中药黄药子毒性研究中的可行性。结果初步确定空白和黄药子组大鼠尿液代谢轮廓图的差异，在主成分得分图中给药后大鼠尿液代谢物组发生变化且被明显分为两类，给予黄药子后大鼠尿液中的代谢物在主成分得分图上的落点离散分类，且黄药子组的代谢产物谱变化与血液生化改变相一致，表明代谢组学可用于中药黄药子肝毒性研究。结论从代谢物组的角度可以诠释传统中药黄药子肝毒性，为传统中药毒性研究从机体整体的观点提供了新的思路、方法和技术手段。 【关键词】 黄药子; 肝毒性; 代谢组学 　　黄药子为薯蓣科薯蓣属植物黄独Dioscorea bulbifera L.的块茎，药性苦寒，具有散结消瘿、清热解毒、凉血止血的作用，其有广泛的药理活性，可用于瘿疾瘤肿等，但其也为肝固有毒物，其毒性严重制约了其在临床上的卓越疗效的发挥。本实验利用能够反映机体真实状态、代表机体整体机能，具有与中医治疗疾病的整体观、辨证观相一致的特点的代谢组学的研究方法[1，2]，通过研究外源性物质(药物)对机体所形成的生化物质的总体代谢调控作用，探讨代谢组学在中药黄药子毒性研究的可行性，为传统中药毒性研究从机体整体的观点提供了新的思路、方法和技术手段。 　　1 仪器与材料 　　1.1 仪器Agilent 1200 RRLC液相色谱仪(美国);安捷伦6510 Q-TOF质谱仪(美国);KDC-160HR高速冷冻离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司);KQ-50B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);MiLLiPORE纯水机(美国密理博公司);微量移液器，SOCOREX(瑞士);GLYZ-0.5B型冷冻干燥机(上海);日立7020型全自动生化分析仪(日立公司，日本)。 　　1.2 药品与试剂黄药子购于黑龙江省药材公司，产地河北，经黑龙江省药检所鉴定，为薯蓣科植物黄独Dioscorea bulbifera L. 的块茎。乙腈为色谱级，美国天地公司;娃哈哈纯净水，再经本室Milli-Q纯水机制备;甲酸色谱级，美国霍尼韦尔公司;丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒、胆红素(TBIL、DBIL)试剂盒、血清总胆汁酸(TBA)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所 (南京，中国)。 　　1.3 动物 Wistar大鼠，雄性，清洁级，体质量(200±20)g(北京维通利华实验动物技术有限公司提供)，动物合格证号：SCXK(京2007-0001)。大鼠于室内保持12h光照，12h避光循环饲养，给予标准饲料和饮用水，且控制室内温度为(22±1)、相对湿度在40%左右。 　　2 方法 　　2.1 样品的采集与制备雄性Wistar大鼠10只，随机分为空白对照组、黄药子组。放入代谢笼(苏州市冯氏实验动物设备有限公司生产)中适应环境后，黄药子组(50 g/kg临床常用剂量的25倍量)，空白组给予同体积生理盐水，连续给药7 d。每天用代谢笼收集大鼠24 h尿液，连续取样7 d，每天早晨8 h收集1次，尿液置于冰中保存。尿液样品于4 13 000 r/min离心10 min，取上清液过0.22 μm微孔滤膜，于低温冰箱中供UPLC-Q-TOF/MS分析。实验结束后处死动物采集血浆。 　　2.2 色谱条件色谱柱为Agielnt zorbax Eclipse C18column (100 mm×4.6 mm 1.8 μm，Agilent，USA);流速0.40ml/min;柱温35;流动相A：0.1%甲酸-水溶液;流动相B:0.1%甲酸-乙腈溶液;进样体积5 μl;梯度洗脱程序(见表1)。二极管阵列检测器全波长扫描，紫外检测器流出液不经分流直接导入质谱系统检测。表1 色谱梯度洗脱程序时间t/minA 　　2.3 质谱条件电喷雾离子源ESI(+);毛细管电压正离子扫描为3 800 V;脱溶剂温度为350;脱溶剂气流量正离子扫描为8 L/min;锥孔气流量为100 L/h;碰撞能为3 V，碰撞气为氮气;碰撞室压力40 psi;准确质量校正采用亮氨酸-脑啡肽(leucine-enkephalin，[M+H]+556.277 1;[M-H]-=554.261 5)溶液;扫描方式为全扫描，质量扫描范围m/z 100～1 000;Ref mass：922.009798118.086255622.02896。 　　2.4 数据处理