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琼胶酶的分离纯化及性质 第54卷第4期 2008年8月 武汉大学(理学版) J.WuhanUniv.(Nat.Sci.Ed.) Vo1.54No.4 Aug.2008,497～502 文章编号:1671—8836(2008)04—0497—06 海洋紫色杆菌琼胶酶的分离纯化及性质 时岩玲,于文功,路新枝 (中国海洋大学IN-药学院,山东青岛266003) 摘要:从青岛近海海水中分离得到一株高产琼胶酶的海洋紫色杆菌SY12.紫色杆菌SY12的发酵液上清经硫 酸铵沉淀,凝胶过滤层析,离子交换层析和凝胶过滤层析等蛋白纯化步骤,得到纯化的野生琼胶酶AgaY.琼胶酶纯化 了133.63倍,酶比活力为320.7U/mg;纯化的琼胶酶经SDS检测,显示为单一条带,其相对分子质量约为50 ×10..研究结果表明琼胶酶AgaY降解琼脂糖的1,4一糖苷键,其主要产物为新琼四糖和新琼二糖.对AgaY进行酶 学性质研究,发现其最适反应pH为7.0,最适反应温度为40¨C;Hg,Ag,Zn2,Cu.’和Ph等金属离子可以显着 的抑制琼胶酶AgaY的活力.研究发现,AgaY的催化活性不依赖于离子的存在,AgaY对EDTA不敏感. 关键词:紫色杆菌;p-琼胶酶;分离纯化;新琼寡糖 中图分类号:Q814.文献标识码:A 0引言 琼胶是红藻细胞壁的主要成分,由琼脂糖和硫 琼胶组成].琼脂糖是由3一O连接的D一吡喃半乳 糖残基和4一O一连接的3,6一内醚一a—L一半乳糖残基交 替连接组成的链状分子l2].琼胶酶(agarase)是能够 降解琼脂糖和琼胶的糖苷水解酶(glycosidehydro— lases).根据其作用方式不同,可以把琼胶酶分为两 类:旷琼胶酶和琼胶酶.a一琼胶酶(EC3.2.1)裂解 琼脂糖的旷1,3一糖苷键,生成以D一半乳糖为非还 原性末端和以3,6一内醚一a—L一半乳糖为还原性末端 的琼寡糖(agaroo1igosaccharides)系列;琼胶酶 (EC2,.2.1.81)裂解琼胶糖的1,4一糖苷键,生成以 I)_半乳糖为还原性末端和以3,6内醚a—L-半乳糖为 非还原性末端的新琼寡糖(neoagaroo1igosaccharides) 系列口”].目前,将从野生细菌的发酵液中分离得到的 琼胶酶进行全长氨基酸序列的同源性分析还很困难, 因此无法对天然分离得到的琼胶酶做家族归属.野生 琼胶酶主要从弧菌属l5],别单胞菌属lg,假单胞 菌属l1和芽孢杆菌属l1H分离得到,降解产物主要 有新琼十糖,八糖,六糖,四糖和新琼二糖,相对分子 质量范围为26×1O.～360×10.. 琼胶酶降解琼脂糖生产的寡糖产品已广泛应用 于食品业,化妆品业和医药工业l1¨].琼胶酶在海 藻的单细胞分离,酶解破壁制备原生质体等过程中 具有重要的使用价值,是一种海藻遗传工程的工具 酶;同时,琼胶酶在分子生物学方面应用于从琼脂糖 电泳中回收DNA和RNAl5].另外,琼胶酶由于琼 胶寡糖具有抗肿瘤,抗炎,抗氧化,预防糖尿病等多 种生理功能而备受关注l1. 不同来源的琼胶酶在氨基酸序列,相对分子质 量大小,底物特异性和催化活性等方面表现出高度 的异质性..本文将对从变形细菌紫色杆菌 Janthinobacteriumsp.SY12中分离纯化得到的一 种新的琼胶酶的酶学性质展开研究. 1材料与方法 1.1菌株与培养基 从青岛近海海水中分离得到紫色杆菌SY12,保 存于本实验室.野生菌种的培养以琼脂粉作为惟一 碳源配制选择性培养基,液体培养基的组成如下: 2.5NaC1,0.5%KC1,0.2%NH4C1,0.5%Mg— SO4?7H2O,0.002FeSO4?7H2O,0.1Nail2 PO,0.02CaC1,0.2琼脂粉,pH7.0.固体培 养基的琼脂粉含量为1.5,其他成分及其含量都 收稿日期:2008—03—04十通讯联系人E—mail:yuwg66@OUC.edu.cn 基金项目:国家重点基础研究发展计划(973)项目(2003CB716402);国家高技术研究发展计划(863)项目(2004AA625020) 作者简介:时岩玲(1976一),女,博士生,主要从事资源微生物生物工程与分子酶学研究.E—mail:cynthia7910@sina.corn 498武汉大学(理学版)第54卷 与液体培养基相同. 1.2琼胶酶的分离纯化 从一8O冰箱中取出菌种Janthinobacterium sp.SY12,复苏后,接种适量的细菌于液体培养基 中,于25.C培养,转速250r/min,培养24h.发酵 培养物经12000r/min离心10min,收集上清液. 将1L发酵上清液在冰浴中边搅拌边缓慢加入研磨 过的硫酸铵粉末至饱和度为65,4IC静置2～5h. 12000r/