肉质相关基因TCAP启动子与转录因子MyoD结合ChIP分析.docVIP

肉质相关基因TCAP启动子与转录因子MyoD结合ChIP分析 　　摘要：为了检测肉质相关基因TCAP（Titin-cap，Telethonin）启动子与转录因子MyoD（Myogenic differentiation antigen）的体内结合情况，采用染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation，ChIP）结合PCR技术分析TCAP启动子与转录因子MyoD的结合。结果表明，以MyoD抗体免疫沉淀的DNA片段为模板，PCR扩增获得了TCAP基因启动区121 bp的片段，实现了转录因子MyoD与TCAP启动子DNA序列结合。试验证实TCAP基因是MyoD调控的下游基因，在肌肉发育过程中发挥重要作用。 　　关键词：染色质免疫共沉淀；TCAP基因；MyoD转录因子 　　中图分类号：Q71 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）22-5612-03 　　动物的产肉潜力及肌肉品质与肌纤维的数量和生长密切相关。TCAP（Titin-cap，Telethonin）蛋白作为一种肌丝蛋白在肌原纤维的组装过程中发挥着重要作用，其在横纹肌和心肌中特异性表达，是肌联蛋白激酶的作用底物，并绑定于肌联蛋白Z1-Z2区，通过连接和支撑肌联蛋白为其他肌纤维蛋白提供空间上固定的结合位点[1]。TCAP基因与肌肉萎缩[2]、心肌症[3，4]、肌营养不良[5]等均相关。在培养的骨骼肌细胞中，通过RNA干扰发现TCAP基因下调表达后会抑制成肌细胞的分化[6]，这些都证实了TCAP基因与骨骼肌发育关系密切。 　　TCAP基因由2个外显子组成，在人、鼠和猪中编码167个氨基酸，在牛中编码166个氨基酸[7]，且在不同物种间高度保守[8]。研究表明牛TCAP基因内含子1和外显子2的SNP位点与肉质性状显著相关[9]。黄京书[10]克隆了猪TCAP基因并发现了4个SNP位点，且G334A位点基因型与猪屠宰率、瘦肉率、6～7腰椎间背膘厚、胸腰椎间背膘厚、臀部平均背膘厚、三点平均背膘厚、眼肌高、眼肌宽、至第一颈椎胴体长、至第一胸肋胴体长极显著相关，且肥肉率、肩部背膘厚、瘦肥比率性状在不同基因型间的差异也达到显著水平。 　　TCAP基因对猪肉质性状有着密切影响，但是其作用的具体机制还不明确。课题组在前期工作中克隆了猪TCAP基因启动子1 662 bp序列，构建了7个启动子缺失片段重组质粒分别转染C2C12细胞。结果表明，各个片段的启动子活性都显著提高，其中-155 bp/+33区段启动子活性最高，推测为潜在的核心启动子区。利用生物信息学技术对猪TCAP基因启动子区序列做进一步分析后发现存在调控肌肉生长发育的肌分化因子（Myogenic differentiation antigen，MyoD）转录因子结合位点，且将构建的转录因子MyoD超表达载体与TCAP基因启动子序列进行共转染，发现启动子活性明显升高，说明MyoD对TCAP基因的表达具有一定的调控作用。故试验采用染色质免疫共沉淀技术（ChIP）体内验证TCAP基因启动子序列与转录因子MyoD的结合情况，进一步探讨TCAP基因影响肉质性状的作用机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　C2C12细胞系来源于华中农业大学，用含10%胎牛血清的DMEM培养基对C2C12细胞进行培养。 　　1.2 试剂 　　染色质免疫沉淀试剂盒EZ-ChIPTM Chromatin Immunoprecipitation Kit，购自美国Millipore公司；MyoD兔抗鼠的单克隆抗体，购自英国Biorbyt公司；VC750型超声波破碎仪，购自美国Sonics公司；BIO-RAD Mylyder PCR仪，购自美国BIO-RAD公司；Taq酶、dNTPs等PCR试剂，购自北京全式金生物技术有限公司；PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 　　1.3 方法 　　1.3.1 细胞交联固定 细胞培养于培养皿中，待细胞汇合度达80%～90%，添加含有1%甲醛的20 mL细胞培养基，室温孵育10 min后加甘氨酸终止交联。置于冰上，用含蛋白酶抑制剂的预冷的PBS冲洗细胞，然后刮取细胞收集到离心管中，于4 ℃、800 r/min离心3 min，加入含蛋白酶抑制剂的SDS裂解液重悬细胞，再按照每管400 μL分装溶解物（约含4×106个细胞），保存备用。 　　1.3.2 超声波破碎细胞及条件优化 调整超声波破碎仪功率大小、破碎时间、停顿时间、重复次数等条件，在冰上破碎细胞，使染色质DNA成为200～1 000 bp的片段，4℃、12 000 r/min离心10 min，弃不容物，将DNA纯化后用1.5%琼脂糖凝胶电泳观察剪切效果。 　　1.3.3 染色质免疫沉