生化实验课件 小鼠肝组织rna提取及rtpcr实验.ppt

小鼠肝组织RNA提取及RT-PCR 一、试剂及材料 1、小鼠肝脏 2、DEPC（焦碳酸二乙酯）处理过的EP管、PCR管 3、 Trizol 、氯仿、异丙醇、DEPC水 异硫氰酸胍/苯酚法 TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。 TRIzol中加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源Rnase 异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可使核蛋白迅速与核酸分离。 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离 二、实验原理 TRIZOL：异硫氰酸胍 + 苯酚（PH5） 裂解细胞，RNA与蛋白质分离，将RNA释放到溶液中。 促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层。 RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。 基因组DNA 水相 有机相 RNA pH5.7 三、实验步骤 RNA提取 1、新鲜肝组织置EP管中，加200?l Trizol充分研磨后，补加800?l Trizol，枪头吹匀。 2、加入200?l 氯仿，剧烈震荡15秒，4℃ 12000g离心15min。 3、将上层水相移至洁净EP管中，加入500?l异丙醇颠倒混匀。 4、4℃ 12000g离心10min。 5、弃水相，EP管开盖干燥，溶于50?l DEPC水中。 RT-PCR：RNA的反转录 + cDNA的PCR RT-PCR操作步骤 5x Prime Script Buffer 2 ?l ① Prime Script RT Enzyme Mix 0.5 ?l ② Oligo dT primer (50 ?m) 0.5 ?l ③ Random 6 mers (`100 ?m) 1 ?l ④ 提取的RNA 0.5 ?l RNase Free 水 5.5 ?l ⑤ 37℃ 15min 85℃ 5 sec 10 ?l 反转录反应时Primer的选择 反转录引物的选择，应结合实验的具体情况，选择以下三种引物，即：Random 6 mers、Oligo dT Primer或特异性下游引物。对没有发夹结构的短链mRNA，上述三种引物都可以使用。 Random 6 mers 适用于长的或具有Hairpin结构的RNA。包括rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA的反转录都可使用该引物。 Oligo dT Primer 适用于真核生物具有Poly(A) 尾的RNA。 特异性下游引物 ?(PCR时的下游引物) 必须与模板序列互补，需了解Target序列。 PCR 10x PCR Buffer 5 ?l dNTP 4 ?l 模板DNA 2 ?l 引物1 2 ?l 引物2 2 ?l Taq 酶 0.5 ?l H2O 34.5 ?l 50 ?l 94℃ 5 min 94℃° 30 sec 54℃° 30 sec 72℃ 30 sec 72℃ 7 min 25 cycle 1%琼脂糖凝胶电泳观察结果 D2000 mark 20ml PCR产物 4ml loading buffer 1ml DNA染料 * * * * * *