谷氨酸甲基化修饰基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱分析.docVIP

谷氨酸甲基化修饰基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱分析 　　摘要[HTSS]利用基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱（MALDITOF/TOF）高置信度地鉴定了枯草芽孢杆菌中的蛋白酶抑制剂和杆菌肽F两种蛋白及其翻译后修饰，发现在这两种蛋白质中共有5个肽段发生谷氨酸甲基化，其中肽段FELVVYDSEHK存在FE（Methylation）LVVYDSEHK和FELVVYDSE（Methylation）HK两种形式。结果表明，MALDITOF/TOF高能CID所提供的丰富断裂信息和全质量范围扫描对提高分析结果的确定性具有重要作用。此外，这5个甲基化肽段都可以检测到相对含量更高的非甲基化肽段，这为降低分析结果的假阳性提供了辅助判据。在低质量区检测到甲基化赖氨酸的亚胺相关离子m/z 98和143，说明发生了赖氨酸的甲基化；检测到m/z 116则提示发生了谷氨酸甲基化。 　　1引言 　　蛋白质的翻译后修饰（Posttranslational modifications， PTMs）是一个高度动态和多样化的过程，与严格的基因表达调控方式相比，PTMs更容易创造蛋白质性质的动态组合库，使得生物体能够快速适应各种环境刺激[1]，因此，PTMs是蛋白质的功能调控、相互作用和动态反应的重要分子基础[2]。PTMs主要包括蛋白质的磷酸化、糖基化、泛素、乙酰化和甲基化等，其中蛋白质磷酸化和糖基化蛋白质组学的研究开展较早，针对这两种化学修饰蛋白建立了多种特异性分离方法[3-7]。 　　目前，对蛋白质的甲基化修饰研究相对较少。早期研究发现，组蛋白赖氨酸与精氨酸残基的甲基化基因转录调控相关[8]。2008年，Sprung等[9]在人肝癌细胞和啤酒酵母中检测到了天冬氨酸和谷氨酸的甲基化修饰；有研究表明，与正常胰管细胞相比，在胰腺癌细胞的α烯醇酶中有更多的天冬氨酸和谷氨酸发生甲基化，提示这些修饰可能参与了与肿瘤相关的病理生理过程[10]，以上工作均是在静电场轨道离子阱质谱（LTQOrbitrap）上完成。目前，尚未见到利用基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱（Matrixassisted laser desorption ionization tandem timeof flight mass spectrometry， MALDITOF/TOF）分析谷氨酸甲基化的报道。本研究以枯草芽孢杆菌为实验材料，通过对一级质谱离子峰丰度的比较和二级串联质谱的分析，阐明利用MALDITOF/TOF质谱分析谷氨酸甲基化的特点和优势，提高含甲基化谷氨酸多肽和蛋白的鉴定置信度，为在组学水平上研究谷氨酸甲基化的生物学功能奠定基础。2实验部分 　　2.1仪器与试剂 　　4800 MALDI TOF/TOFTM Analyzer基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱仪（MALDITOF/TOF，美国Applied Biosystems/MDX SCIEX公司），仪器控制软件为4700 Series Explorer Software；超纯水处理系统（ MilliQ，美国Millipore 公司）；蛋白纯化系统（AKTA FPLC，美国GE公司）；320S型pH计（梅特勒托利多仪器上海有限公司）；胰蛋白酶（质谱分析级，Promega公司）；α腈基4羟基肉桂酸（美国Sigma公司，使用前重结晶）；乙腈和三氟乙酸等其它试剂均为分析纯或优级纯。 　　枯草芽孢杆菌从深圳红树林海泥中分离。 　　2.2胶内胰酶水解条件 　　切胶：将双向电泳分离后的目标条带用移液枪枪头切下，小心地放入PCR管；脱色：用100 μL 高纯水振荡洗涤10 min，重复3次；100 μL 25 mmol/L NH4HCO3室温振荡平衡20 min；100 μL 25 mmol/L NH4HCO3/50%乙腈室温振荡30 min；干燥胶粒：100 μL 25 mmol/L NH4HCO3室温振荡平衡20 min；加100 μL 100%乙腈于胶粒中静置10 min，重复1次；酶解：加入5 μL 20 mg/L质谱用测序级胰蛋白酶，4 ℃放置30 min，使酶液完全浸透胶粒，吸掉多余的酶液；加入5 μL 40 mmol/L NH4HCO3/10% CAN混合液， 37 ℃水浴8 h。 　　2.3质谱分析条件 　　基质制备：将6 g/L α腈基4羟基肉桂酸和2 g/L 柠檬酸氢二胺溶于10 mL 50%乙腈（含0.1%三氟乙酸），基质溶液与蛋白酶解液1∶1混合后点于不锈钢靶版，自然干燥结晶后待测。采用正离子反射模式，一级质谱每张谱图累加800次，二级质谱累加1200次，碰撞诱导解离条件为： 碰撞能加空气碰撞1 kV（gas on），源内电压8 kV，碰撞池电压7 kV，二级源加速电压15 kV。 　　2