分子诊断-生物大分子的分离纯化.pptVIP

第三章 生物大分子的分离纯化 生化教研室：辇晓峰 Tel什么是生物大分子（biomacromolecule） 生物大分子有何功能 为什么要分离纯化生物大分子 生物大分子是指生物体内由分子量较低的基本结构单位首尾相连形成的多聚化合物。 DNA和RNA是生物体的遗传物质。蛋白质是一切生命活动的物质基础。 基因及蛋白的异常是人体疾病发生、发展的基础，故生物大分子的分离与纯化是分子生物学及分子诊断的最重要的基础工作。 本章内容提要 核酸的分离纯化 原则及技术路线的设计（核酸浓度、纯度、完整性的检测方法及保存方法） 真核基因组DNA的分离纯化 质粒DNA的提取与纯化 真核细胞RNA的分离纯化（提取总RNA的方法、制备mRNA的方法） 蛋白质的分离与纯化 技术路线设计及条件 材料选择与预处理 细胞破碎的方法 蛋白质分离纯化方法 蛋白质样品的纯度鉴定 蛋白质的定量和分子量测定 第一节 核酸分离纯化的设计及原则 基因组总长度一般随生物进化程度而增大。 与DNA相比，RNA要小得多，其种类、大小和结构具多样化，主要存在于细胞质中。 DNA对碱相对稳定，RNA对酸相对稳定，但不能极端。 DNA与RNA理化性质及细胞定位的差异决定了二者最适分离与纯化的条件是不同的。 一、材料与方法的选择 材料与方法的选择 来源多 核酸存在于动植物细胞及各种微生物之中。临床诊断常见的标本包括血液、尿液、唾液、组织及培养的细胞。 分离纯化的方法多 核酸的完整性、纯度、产量及浓度 制备所需时间与成本 商品化的试剂盒与自动化仪 选择的原则 保持核酸碱基序列的完整性 完整的一级结构是核酸结构和功能研究以及基因诊断的最基本要求 尽量清除其他分子的污染，保持核酸制品 的纯度 满足后续研究及诊断的要求 保持核酸的完整性 整个操作过程中尽量避免各种有害因素对核酸的破坏 物理：剪切力、高温 0-4℃ 化学：酸、碱、有机溶剂 pH4-10 生物学：DNase及RNase 不可避免的有害因素要采取措施尽量减轻对核酸的破坏 简化提取纯化步骤、缩短分离时间，避免剧烈震荡； 加入金属离子螯合剂抑制DNase活性，加入DEPC (二乙基焦碳酸盐) 抑制RNase活性 细胞应完整，相关器皿及试剂应提前消毒 二、技术路线的设计 核酸的释放 核酸的分离与纯化 非核酸的大分子污染物 非需要的核酸分子 在分离纯化过程中前后加入的对后续研究与诊断有影响的溶液及试剂 核酸的浓缩沉淀与洗涤 沉淀是浓缩核酸最常用的方法。 优点： ①重新调整核酸的浓度； ②去除溶液中某些盐离子与杂质。 核酸的有机溶剂沉淀法的原理 当核酸溶液的pH值大于4时，核酸分子呈多聚阴离子状态，当加入一定浓度的盐后，核酸分子与1价或2价阳离子形成盐，通过屏蔽带负电荷的磷酸基团，使DNA、RNA分子聚集在一起而不溶于许多有机溶剂，此外，这些盐在许多有机溶剂中亦不溶解，也不会被有机溶剂变性，因此常在加入一定浓度的盐后，用有机溶剂沉淀抽提液中的核酸。 常用的盐类有NaAc、 KAc 、NH4Ac、 MgCl2 、KCl、NaCl 常用的有机溶剂为乙醇、异丙醇和聚乙二醇。 核酸沉淀中常含有少量共沉淀的盐，需用70%乙醇洗涤去除。 核酸的鉴定与保存 核酸的鉴定 浓度鉴定 1）紫外分光光度法 原理：核酸分子中的碱基具有共轭双键结构，可吸收紫外线，最大吸收波长为260nm。此法测定核酸的灵敏度为0.25μg/ml。 在波长260nm紫外光下， 1.000A260（1OD值）的吸光度相当于50μg/ml双链DNA； 1.000A260=33μg/ml单链DNA ； 1.000A260= 40 ug/ml单链RNA 若DNA样品中含盐，会使A260偏高。此时必须测定A310以扣除背景，以 A260— A310的差值作为定量计算的依据。 2）荧光光度法 荧光染料溴化乙锭（EB），嵌入碱基平面，在UV激发下发出红色荧光，强度与含量呈正比。 该法灵敏度高达1-5ng。 新型超灵敏荧光染料SYBR Gold可检出低至20pg的ds-DNA 核酸的鉴定 纯度鉴定 1）紫外分光光度法 A260/A280的比值来判断有无蛋白的污染。 纯的DNA样品A260/A280应为1