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碱性脂肪酶高产菌株筛选及产酶条件优化 　　摘要 利用筛选和验证相结合的方法筛选出了产碱性脂肪酶活性较高的菌株BL1011。经过形态观察、生理生化试验及分子生物学鉴定，结果表明该菌株为假单胞菌（Pseudomonas sp.）。运用单因素试验和均匀试验优化了BL1011菌株摇瓶产酶培养基和最佳发酵条件。在培养基为麦芽糖2.5%，蛋白胨3.0%，大豆油0.5%，K2HPO4 0.2%，培养条件为起始pH值7.5，温度33 ℃，转速180 r/min，装液量20 mL，发酵周期为60 h的条件下，酶活力达到最高，为223 U/mL。 　　关键词 脂肪酶；筛选；发酵优化；均匀试验 　　中图分类号 Q55 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2012）22-0274-03 　　脂肪酶（lipase，E.C.3.1.1.3，又称三酰基甘油水解酶）是一种特殊的酯键水解酶，能在油水界面催化油脂水解，生成甘油和脂肪酸，具有化学选择性和底物选择性[1]。脂肪酶被广泛应用于食品、轻纺、皮革、香料、化妆品、洗涤剂、有机合成、医药等领域[2]。尽管自然界中产脂肪酶的微生物很多，但用于商业化生产的细菌很少，主要有伯克霍尔德氏菌（Burkholderia）、无色杆菌属（Achromobacter）、假单胞菌属（Pseudomonas）、色杆菌属（Chromobacterium）、产碱杆菌属（Alkaligenes）、节杆菌属（Arthrobacter）[3]。假单胞菌产碱性脂肪酶国内外虽有研究，但酶活力均不高[4]。该研究通过罗丹明B平板法快速筛选出一株产碱性脂肪酶能力较强的菌株，并对其产酶条件进行优化研究。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　1.1.1 菌株。细菌：BL1001-1020；酵母：BL2001-2015；霉菌：BL3001-3025。试验菌株均由郑州轻工业学校食品与生物工程学院酶分子工程研究室保藏。 　　1.1.2 培养基。①种子培养基。细菌用调整LB培养基（pH值8.0），酵母用YPD培养基，霉菌用PDA培养基。②发酵培养基。细菌：蔗糖0.3%，酵母膏0.2%，蛋白胨0.5%，（NH4）2SO4 0.1%，K2HPO4 0.2%，豆油0.5%，pH值8.5；酵母：麦芽糖0.3%，酵母膏0.2%，蛋白胨0.5%，（NH4）2SO4 0.2%，KH2PO4 0.2%，豆油0.5%，pH值8；霉菌：酵母膏0.2%，（NH4）2SO4 0.5%，KH2PO4 0.15%，Na2HPO4 0.35%，豆油0.1%，pH值8。③罗丹明B验证培养基。蔗糖0.3%，酵母膏0.2%，蛋白胨0.5%，（NH4）2SO4 0.1%，K2HPO4 0.2%，豆油0.5%，罗丹明B数滴，琼脂2%，pH值8.5。④基础培养基。麦芽糖0.5%，蛋白胨1%，K2HPO4 0.2%，pH值7.5。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 摇瓶产酶初筛。将上述不同菌株接入相应的种子培养基中培养，然后按2%的接种量接种到对应的发酵培养基中，细菌在37 ℃、200 r/min条件下发酵48 h，酵母和霉菌在28 ℃、180 r/min条件下发酵72 h后测定发酵上清液中的脂肪酶酶活，选择酶活力最高的菌株BL1011作为试验菌株。 　　1.2.2 碱性脂肪酶活力的测定[4]。采用分光光度法测定脂肪酶酶活。将酶活定义为60 ℃、pH值8.5时，1 min分解底物（对硝基苯酚十二烷酸酯）释放1 μmol对硝基苯酚的需酶量（U/mL）。 　　1.2.3 BL1011产酶验证[5]。采用罗丹明B平板对BL1011菌株是否产脂肪酶进行验证。倒罗丹明B平板，点种BL1011菌株后于30 ℃恒温培养箱中培养72 h，分泌胞外脂肪酶的菌株周围会出现橘红色的圈，依据平板上是否形成橘红色圈进行产酶验证。 　　1.2.4 BL1011菌株产酶条件的单因素试验。该试验的单因素条件包括碳源、氮源、诱导剂、无机盐离子、起始pH值、温度、转速、时间。 　　1.2.5 BL1011产酶条件参数优化。根据单因素试验结果，设计均匀试验进一步优化产酶最佳配比和条件。 　　2 结果与分析 　　2.1 菌种筛选 　　2.1.1 摇瓶产酶筛选。摇瓶产酶筛选结果如表1所示，综合考虑酶活和最适pH值2个因素，选择BL1011作为试验菌株。 　　2.1.2 平板验证结果。将BL1011菌株点种到罗丹明B平板上，于37 ℃恒温培养箱中培养72 h，该菌株产生橘红色圈大而清晰，可以确定该菌株所产酶为脂肪酶。 　　2.2 BL1011菌株鉴定 　　2.2.1 BL1011菌落形态观察试验。BL1011的菌落呈圆形，边缘整齐，淡黄色，透明，正反面颜色一致；该菌株的细胞为短杆状