TSH荧光酶免疫分析法1 - 广东省新生儿疾病筛查网.ppt

TSH荧光酶免疫检测法 佛山市新生儿疾病筛查中心 刘海平 一、先天性甲低的新生儿筛查方法 1、酶免疫分析法 (enzymelmmunoassay，EIA) 2、放射免疫分析法 (radioimmunoassay，RIA) 3、免疫放射法 (immunoradiometricassay，IRMA)  一、先天性甲低的新生儿筛查方法 4、时间分辨荧光免疫分析法 TRFIA me-resolvedfluorescenceimmunoas—say 5、荧光酶免疫分析法FEIA fluoreseenceenzymeimmunoassay 6、自动新生儿疾病筛查系统(automatednewbornscreeningsystem) TSH荧光酶免疫分析法 1、原 理 1．原理 荧光酶免疫分析法(FEIA)是一种高度灵敏的检测方法，用FEIA测定血hTSH基于一步夹心法原理，采用固相、双位点荧光酶免疫分析法。 干血斑中洗涤出的hTSH，同时与包被在酶标板上抗hTSH的单克隆抗体分子和辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗hTSH—亚基的第二抗体结合。  2HPPA+H2O2 DPDPA+2H2O 原理 以甘氨酸缓冲液终止酶反应。 原理 用荧光读数仪以320nm为激发光，405nm为发射光测定荧光值。由于荧光强度与酶标反应板上结合的hTSH数量成正比，因此，通过已知浓度的标准血斑荧光值和样本的荧光值，也就可换算出样本血斑中hTSH的含量。 特点： ①荧光物质为DPDPA，是由HPPA与双氧水在HRP的作用下脱氢结合而成，它吸收特定波长（320nm）的光能后，发生原子重排，同时发射出更长波长（405nm）的光。 特点： ②鉴于HPPA（3-P-羟基苯丙酸）敏感性高、动力学范围广，已被广泛用于替代传统EIA显色剂，作为辣根过氧化物酶的底物。以HPPA作底物的FEIA可检测极低和极高浓度，具有明显优势，由于hTSH样本正常值与非正常值之间差异大，故该法特别适用于hTSH检测。 特点： ③HPPA／H2O2反应生成的荧光强度的影响因素中，最重要的是底物浓度、反应液和终止液的pH值。酶反应最佳pH值为7.8。加入碱性缓冲液终止酶反应，又可显著增强荧光强度。经测定，使用pH10.3、1.5 mol／L甘氨酸缓冲液可获得最大荧光强度。在低浓度hTSH下，该缓冲液可使荧光强度增加5倍，当hTSH浓度高于80mIU／L时，增强作用依次减弱。 特点： ④荧光产物稳定，可放置过夜后测定。无论在室温(20～25℃)或30℃孵育用FEIA测定hTSH的敏感性无变化；而在37℃条件下孵育会增加背景荧光，降低灵敏度。建议底物孵育温度为20～30℃。 特点 ⑤FEIA检测法方法先进，重复性高。 一般情况下，批内分析变异系数和批间分析变异系数均小于10％。 特点 ⑥应用FEIA法进行hTSH检测时，其他垂体激素和人绒毛膜促性腺激素(HCG)对实验的干扰极小。 2、仪器和试剂 以下仪器均由芬兰Labsystems公司提供 (1)、仪器： ①、荧光读数仪；②、孵育／振荡仪；③、自动洗板仪；④、3mm打孔器，或打孔钳；⑤、加样器；八道加样器。以上仪器均由芬兰Labsystems公司提供。⑥、3mm实验血片塑料支架；⑦、电脑、打印机；⑧、冰箱。 材料 ①、新生儿筛查滤纸干血斑标本：用SS903滤纸，按新生儿疾病筛查滤纸干血斑标本采集方法采集； 试剂 试剂 ①、抗hTSH包被的酶标板（1）：抗hTSH抗体IgG(小鼠单克隆抗体)包被的酶标板，浓度1.0μg/m1。所有包被酶标板均置于有干燥剂的锡箔密封袋中以防止潮湿。潮湿将破坏酶标板的包被，严重缩短试剂盒保存期。试剂盒通常储存在2—8℃，为防止打开锡箔密封袋时水蒸气凝结破坏酶标板性能，试剂盒使用前需置室温半小时后再打开。若锡箔密封袋在使用前受损或干燥剂变色，请勿使用； ②、抗hTSH—HRP酶结合物（2） ：辣根过氧化物酶标记的抗hTSH(小鼠单克隆抗体浓度50ngIgG／m1)抗体，加0．2％的KathonCGe作为防腐剂； 试剂 ③、酶结合物稀释液（3） ：缓冲盐溶液，pH6.5，加0.2％的KathonCG~作为防腐剂。用于酶结合物的稀释； ④、HPPA荧光底物（4a） ：3—P—羟基苯丙酸溶于Tris缓冲液(pH7.8)中，加0.2％的KathonCGe作为防腐剂； ⑤、H2O2溶液（4b） ：柠檬酸—醋酸缓冲液，pH6.0，含过氧化氢。避免与氧化／还原剂接触； ⑥、终止液： 甘氨酸缓冲液（5） ，pH10.3； ⑦、洗涤液（6） ：含有吐温20的磷酸盐缓冲液，加入0.