凝胶过滤层析简介..ppt

content * 凝胶过滤层析技术 凝胶过滤的基本原理 凝胶分类与性质 凝胶过滤的基本操作 凝胶过滤层析的应用 凝胶过滤层析技术 Services 凝胶过滤法又称为分子筛层析、凝胶层析或排阻层析,是利用凝胶的网状结构根据分子大小进行分离的一种方法。凝胶过滤所用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的内部是多孔的网状结构。单个凝胶珠本身象“筛子”,不同类型凝胶的筛孔的大小不同。 |基本原理 原理 分子 洗脱体积 分配系数 Services |基本原理 凝胶过滤层析过程示意图 原理 分子 洗脱体积 分配系数 Services |基本原理 我们将要分离的分子分为三类 原理 洗脱体积 分配系数 分子 原理 Services |基本原理 1、外水体积：指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，即凝胶颗粒间液体流动相的体积。（用Vo表示） 2、内水体积：指凝胶颗粒中孔穴的体积，即凝胶层析中固定相体积。（Vi） 3、基质体积：指凝胶颗粒实际骨架体积。（用Vg表示） 4、柱床体积：指凝胶柱所能容纳的总体积。（用Vt表示） 5、洗脱体积：指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。（用Ve 表示） Vt=Vo+Vi+Vg 分配系数 原理 洗脱体积 分子 分子 Services |基本原理 最先流出物质A，A分子量最大，完全不能进入颗粒内部，只能从颗粒间隙流过， “全排阻”。其洗脱体积最小，等于外水体积V0。 最后流出物质C，它分子量最小，其分子可以自由进出凝胶颗粒， “全渗入”。洗脱体积是外水体积与内水体积之和V0+Vi。 物质B分子量介于渗入限与排阻限之间，其分子能够部分地进入凝胶颗粒中。 “部分排阻”或“部分渗入”。洗脱体积Ve是全部外水体积加上内水体积的一部分，即Ve=V0+KdVi 分配系数 原理 洗脱体积 分子 分子 分子 洗脱体积 原理 Services 分配系数 |基本原理 当Kd=1时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。 当Kd=0时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。 0＜Kd＜1时，洗脱体积Ve=Vo+KdVi，为部分渗入。 分配系数Kd 分配系数是指某个组分在固定相中和流动相中的浓度比，对于凝胶过滤，分配系数表示组分在内水体积和在外水体积中的浓度分配关系 Kd = 对于某一型号的凝胶，在一定分子范围内，各个组分的Kd与其分子量对数呈线性关系 测定分子量 凝 胶 含大量液体的具三维网状开孔弹性结构的多聚体结构，一般制成球状颗粒。 |分类与性质 性 能 多孔、亲水、惰性、稳定、色谱性能好 凝胶 分类性质 凝胶 凝胶 分类性质 |分类与性质 葡聚糖凝胶 (Sephadex) 结 构 稳定性 色谱性 |分类与性质 聚丙烯酰胺 (Bio-Gel p-x) 凝胶 凝胶 分类性质 结 构 稳定性 色谱性 |分类与性质 交联丙烯基葡萄糖 (Sephacryl) 凝胶 凝胶 分类性质 结 构 稳定性 色谱性 |分类与性质 琼脂糖凝胶 (Sepharose) 结 构 制 备 色谱性 产品名因生产厂家不同而异 稳定性 凝胶 凝胶 分类性质 |分类与性质 交联琼脂糖 (Sepharose) 凝胶 凝胶 分类性质 结 构 稳定性 色谱性 |分类与性质 新型凝胶 superose superdex 凝胶 凝胶 分类性质 | 基本操作 凝胶的选择 凝胶的处理 选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保证。选取何种凝胶及其型号、粒度。 凝胶的性质 分离目的和样品的性质 对生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式 类分离——将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类 分级分离——将分子量相差不很大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白 后者对实验条件和操作要求都比较高 （1）使大分子的分配系数Kd=0； （2）小分子的Kd=1。 （1）使各种物质的Kd值尽可能相差大。 （2）不使分子量分布在凝胶分离范围的一侧。 （3）分子量大于渗入限的3倍，并小于排阻限的1/3。 细粒凝胶柱流速低，洗脱峰窄，分辨率高，用于精制分离或分析。 粗粒凝胶柱流速高，洗脱峰平坦，分辨率低，用于粗制分离，脱盐。 干凝胶加入5、10倍的蒸馏水→充分浸泡→去小颗粒→用0.5mol/LNaoH—0.5mol/L NaCl溶液浸泡0.5h →去碱液→蒸馏水洗至中性 除去凝胶中的气泡的方法 抽气 加热煮沸 注意点:避免置于酸或碱溶液中加热 凝胶 层析柱 加样洗脱 再生保存 | 基本操作 柱的选择 柱的装填 同样直径的层析柱 长层析柱比短的分辨率高； 同样长度的层