上海市临床科研基本实验技能培训 哺乳动物细胞培养：基础交流.ppt

上海市临床科研基本实验技能培训——哺乳动物细胞培养：基础交流 目录 细胞培养基本概念 细胞培养基本要求 细胞培养基本技术 锐赛细胞相关技术服务 一、细胞培养基本概念 细胞培养定义 细胞培养简史 生长类型 细胞形态 传代次数 细胞培养定义 定义： 模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。 优点： 1．活细胞：同时、大量、均一性、重复性； 2．可控制：各种物理、化学、生物等因素可调控； 3．研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记； 4．应用广：不同物种、不同年龄、不同组织、正常或异常（肿瘤）； 缺点： 人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同； 当细胞被置于体外培养后，生活在缺乏动态平衡的环境中，时间久了，必然发生变化。 细胞培养简史 细胞类型 按生长方式: 贴壁型细胞（Monolayer cells） 悬浮型细胞（Suspension cells） 绝大多数有机体细胞属贴壁型细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。 按细胞形态(贴壁细胞）： 成纤维型细胞（Fibroblast-liked cells） 上皮型细胞（Epithelium-liked cells） 其它，不定型 原代培养与细胞系 二、细胞培养基本要求 常用仪器设备 培养器皿 培养基 血清 其他细胞培养试剂 常用仪器设备 超净台或生物安全柜：细胞操作 CO2 培养箱：细胞培养 液氮罐：细胞长期冻存 37℃ 水浴：培养溶液预热，细胞复苏 倒置显微镜：观察细胞 离心机：收集细胞，细胞常用300g转速5min 冰箱：细胞培养溶液分装储存 负压吸引器：细胞培养废液吸取 超净台或生物安全柜 细胞培养基 干粉培养基和液体培养基 干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。缺点是配制过程繁琐，质量不易控制 液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，而且使用十分方便 常用的培养基种类 RPMI-1640（标准型）、DMEM-高糖（标准型）、DMEM-低糖（标准型）、McCoys 5A、M199、F12等 培养基的选择 没有一定的标准，有几点建议可供参考： 建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。 其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。 用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。 血清使用注意事项 血清必须贮存于–20 ～ -70℃，若存放于4℃，请勿超过一个月。如果一次无法用完一瓶，可将40～45 ml 分装于无菌50 ml 离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10 %， 必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。  血清解冻步骤(逐步解冻法): -20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由–20℃直接至37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。 热灭活（heat-inactivation）是指56℃, 30 分钟加热已完全解冻之血清。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement) 去活化。除非必须，一般不建议作此热处理，因为会造成沉淀物之显著增多，且会影响血清之品质。 勿将血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质 血清沉淀物 凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成，这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沉淀物，可用离心3000 rpm, 5 min 去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沉淀物，因为会阻塞过滤膜。  显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沉淀物的形成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在37℃中欲培养此“微生物“，但在37℃环境下，又会使此沉淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。 谷氨酰胺 谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，4