上海市临床科研基本实验技能培训65.ppt

上海市临床科研基本实验技能培训——哺乳动物细胞培养：基础交流;目录;一、细胞培养基本概念;细胞培养定义;细胞培养简史;细胞类型; 成纤维型细胞 梭形或不规则三角形 中央有卵圆形核 胞质向外伸出长短不同的突起 中胚层间质起源;接触抑制（Contact inhibition）;体外培养的细胞增殖能力不是无限的，传代次数有一定的界限，称为“ Hayflick极限”。 传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3年，传代12次；龟寿命200年，传代140次。 传代次数与个体年龄成反比：人胚胎，40-60代； 幼年，20-40代；成年，10-30代；早老病儿童，2-10代。 ;High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, RS, your reliable cooperator! ; The American Type Culture Collection (ATCC) The European Collection of Animal Cell Culture (ECACC) National Institute of Health (NIH), USA National Cancer Institute (NCI), USA;二、细胞培养基本要求;常用仪器设备;超净台或生物安全柜;Culture flask;细胞培养基;培养基的选择;血清使用注意事项;凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成，这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沉淀物，可用离心3000 rpm, 5 min 去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沉淀物，因为会阻塞过滤膜。  显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沉淀物的形成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在37℃中欲培养此“微生物“，但在37℃环境下，又会使此沉淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。 ;谷氨酰胺;酚红;细胞消化液;三、细胞培养基本技术;鼠胎组织细胞原代培养;换液： 全量换液和半量换液 换液时机的选择： 培养液pH值：细胞生长旺盛，代谢产生酸性物质积累增多， pH值下降，营养液酸化变黄，。 细胞状态;细胞传代;细胞冻存;细胞复苏;细胞计数及活力;细胞污染;细菌污染 ;真菌污染;细菌和真菌的清除 ;95％以上是以下四种支原体： 口腔支原体（M.orale） 精氨酸支原体（M.arginini） 猪鼻支原体（M.hyorhinis） 牛莱氏无胆甾原体（A.laidlawii） 危害： 世界性问题，平均发生率达到11% 能改变细胞的DNA,RNA及蛋白表达 不能通过可视法对其进行检测 对细胞的生长率影响较小，不易引起注意污染 来源： 操作环境不良 操作人员的疏失 实验器具不洁等 已受污染的细胞 已受污染的培养基、血清;荧光染色法 电镜检查：扫描电镜、透射电镜 支原体培养 聚合酶链反应(PCR)法 ;细胞营养液常常仍清亮但变黄,细胞生长变缓，部分细胞发生脱落等等，细胞间隙可见铺满细沙样小点。; 支原体的清除 ;四、锐赛细胞相关技术服务;上海锐赛生物简介;锐赛细胞相关技术服务;细胞转染;流式细胞检测;肿瘤细胞生物学检测;病毒包装系统;RNA干扰;High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, RS, your reliable cooperator! ;s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0z)ws!pXmUjRfOcL9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)vs!pXmUiRfOcK9H6E2B+x(u%rZoWlThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)vs#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXlUiQfNcK8H5E2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1