人外周血单个核细胞分离及T细胞受体的检测-医学免疫学.ppt

Dep.Immuno.韩艳非 淋巴细胞的分离与鉴定 细胞免疫功能测定 淋巴细胞增殖功能检测 细胞表面分子检测 细胞毒试验 …….. 内容及目的 内容： 人外周血单个核细胞的分离 Ｔ淋巴细胞受体的检测－－Ｅ花环形成实验 目的： 掌握单个核细胞分离的原理及方法 掌握Ｅ花环形成实验的原理及操作方法 实验一 人外周血单个核细胞的分离 Preparation of Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) of Human 细胞分离纯化 测定细胞免疫功能首先要从人或动物外周血或组织中获取有活性的细胞，如淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞等。取得有活性的细胞应根据不同目的，采用不同方法，考虑 (1)细胞活力；(2)细胞获得量；(3)细胞纯度； 人外周血单个核细胞：Ficoll-hypaque 密度梯度离心法 Ficoll密度梯度离心法 聚蔗糖-泛影葡胺(F／H)分层液比重: 1.077±0.001 。 红细胞、粒细胞比重大(1.092)，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重(1.070)，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。 操作步骤 采血：无菌采血3 ml，注入盛有肝素的抗凝管中，立即轻轻摇匀。 稀释：用无菌吸管加入等体积的RPMI-1640液充分混匀。 加样：吸取淋巴细胞分层液3ml置于一离心管中，管倾斜45度，将稀释后的血液在距分层液液面1cm处沿管壁缓慢加至分层液上面。(NOTE：不要打破血液与分层液的界面) 分离：18～20℃，2500rpm，20min.（四层.） 回收：将0.5ml吸管直接插入灰白层，沿管壁轻轻吸出灰白层单个核细胞，放入新的离心管中，用5倍体积1640液洗涤2次，每次2000rpm，10min.(NOTE：尽量少吸分层液) 实验二 T淋巴细胞受体的检测 （E-花环试验） Detection of ER of T Lymphocyte 原理 T细胞表面有绵羊红细胞（SRBC)受体，称为E受体(ER)，ER即为CD2(或LFA-2)。T细胞与SRBC混合孵育，形成以T细胞为中心，四周环绕SRBC的如玫瑰花样的细胞集团，称为E-玫瑰花环实验或E-花环形成实验。 实验步骤 分离制备PBMC，调制浓度为1*106/ml。 取1ml浓度为1*106/ml的PBMC细胞悬液，2000rpm, 10min。倾倒弃上清。 等量10％NCS（0.1ml)重悬细胞。 加入1％SRBC悬液0.2ml，轻摇混匀；37℃预温，5min 1000rpm，5min 4℃，1.5 h。 取出，弃上清（保留0.1~0.2ml)。轻转离心管，使细胞重悬。 滴加0.8％戊二醛0.1ml，混匀，4℃，15min。 取出，轻旋，重悬细胞，制备血涂片（涂片）。 染色（瑞氏染色），镜检。 镜检：计数200个淋巴细胞，周围粘附3个或3个以上SRBC的淋巴细胞为E花结形成细胞（即T细胞）。 ? 注意事项： 避免将单核细胞及多形核粒细胞计算在内。 油镜使用后用擦镜纸拭干镜头，摆开物镜，收箱。 ???实验材料分配：（2人/组） 肝素管及淋巴细胞分离管 1支 /1组 细胞计数板 1块/2组 Hank’s液 1瓶/列 0.8%戊二醇 1瓶/班 1%冰醋酸 1瓶/班 绵羊红细胞 3瓶/班 * * 韩艳非 免疫教研室 　 BLOOD SMEAR PMN Bas Lym Mon Eos Pla PMN PMN Lym RBC 实验方法 包括：单核细胞、淋巴细胞 (90%) 比重：1.077 比重：1.092 Ficoll 比重：1.070 Ficoll密度梯度离心法分离PBMC 细胞计数： 加1mlRPMI-1640（10％NCS）溶液，吹打混匀。制备成PBMC细胞悬液。 混匀细胞悬液，吸取0.1mlPBMC悬液加于0.9ml冰醋酸溶液中，混匀，用微量加样器取少量（20微升）加于细胞计数板上，在低倍显微镜下计数4大格内细胞总数，乘以25000，即得细胞悬液的浓度。Go Back ( 注：一般每ml健康成人血可分离1~2×106个单个核细胞，其中90%以上为淋巴细胞，部分是单核细胞) 计数原则： 计上不计下，计左不计右。 三个细胞以上的细胞