人白细胞介素一2突变体在大肠杆菌表达系统的表达鉴定.PPT..ppt

人白细胞介素一2突变体在大肠杆菌中的克隆表达与鉴定及其发酵工艺 制作人：吴海韬 班级：强化0903 日期：2012.3.28 1 主要内容 三、IL-2工程菌的构建 四、 IL-2工程菌的发酵培养与控制 主要内容 二、大肠杆菌表达系统分析 一、IL-2的功效及其研究意义 2 IL-2的功效及其研究意义 白细胞介素一2(IL 一2)是一种重要的细胞因子 ，由Morgan等1976年首先发现，并称其为“T细胞生长因子”1979年在第二届国际淋巴因子研讨会上正式命名为白细胞介素一2． 3 人白细胞介素一2突变体简介 成熟的IL-2分子，分子量约为15kDa，主要由CD4+ T细胞产生，广泛参与机体的免疫调节． 其主要功能是促进T细胞的增殖，除此之外IL-2还有诱导细胞毒性T淋巴细胞产生和增殖、促进NK细胞的活化、分化和增殖等过程、增殖分化B细胞作用、与其它细胞介素等协同作用。 前景良好，可广泛应用于提高免疫力、抗肿瘤、抗病毒、抗移植免疫、治疗传染性疾病等多方面。 4 IL-2的功效及其研究意义 以前，基因工程生产人IL-2较为常用的是毕赤酵母，但毕赤酵母表达系统易污染，表达周期长，而且以易燃的甲醇为诱导物，在后期处理中不宜除去，表达产物的卫生安全性需要考虑。 与之相比，原核表达系统具有操作简便，成本低廉，表达量高等特点。目前，在大肠杆菌中表达人白细胞介素-2三突变体近年来已获得很大的应用。 5 大肠杆菌表达系统 目前，已被用于表达外源蛋白质的表达系统有细菌（大肠杆菌和枯草杆菌）、酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞等。但比较而言，大肠杆菌表达系统具有明显的优越性： 1. 对大肠杆菌的背景知识（完成基因组全测序），特别是基因表达调控的分子机理有（乳糖操纵子）深刻的了解； 2. 是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体； 3. 许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效、高水平的表达； 4. 大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用于批量生产。 6 大肠杆菌表达系统 但是，同样的，大肠杆菌表达体系也有诸多不足： 1. 真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很大的差别。 2. 真核基因的转录信号同原核的不同。 细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。 3. 真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异，影响真核基因mRNA稳定性。 7 大肠杆菌表达系统 4. 许多真核基因的蛋白质产物，都要经过转译后的加工修饰（正确折叠和组装），而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中并不存在； 5. 细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。 6. 大肠杆菌周质内存在各种内毒素。 8 大肠杆菌表达系统 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数 转录水平 翻译水平 9 大肠杆菌中外源基因的表达调节 从转录水平上看，影响外源基因转录的主要因素是启动子的强弱和转录终止子的有效性等。 从翻译水平看，影响基因表达的因素是翻译起始区、密码子、mRNA的二级结构以及翻译终止效率等。 培养条件的调节包括培养液成分、温度、诱导剂及诱导量、菌体生长密度及培养时间等。 在实际工作中，由于表达载体及外源基因不同，表达调节因素也有区别，应结合外源蛋白的性质及表达载体的特点选择恰当的表达条件。 10 常用的大肠杆菌表达载体 迄今为止，基因工程学家已经设计并构建了一系列的以原核启动子取代真核启动子的质粒表达载体系统。 最常用的：噬菌体的PL启动子，大肠杆菌的Lac启动子、Trp启动子，以及pBR322质粒的-内酰胺酶启动子等一批强启动子构成的。 11 大肠杆菌的转化方法 操作步骤： （1）将处于对数生长期的新鲜培养物（0.5-0.6OD)，于4℃, 4000转/分钟离心10分钟，回收细菌细胞； （2）将细胞用0℃的0.1mol/L CaCl2溶液重新悬浮细胞沉淀，以诱导细胞感受态产生； （3）加入适量的DNA后，于42 ℃热处理90秒； （4）将混合物快速转移到冰浴中，是细胞冷却1-2分钟，加入适当的培养基在37 ℃培养45分钟，使细胞复苏，并表达质粒所携带的转化基因； （5）选择培养基培养，选择转化体。 12 大肠杆菌的转化方法 2、Hanahan转化法 1983年由Hanahan设计。它的特点是在感受态细胞的诱导方面，除了用CaCl2和MnCl2等二价离子按一定形式组合方式处理细胞外，还利用二甲亚砜（DMSO）、二硫苏糖醇（DTT）和氯化六氨合高钴等进一步处理细胞，其它方面与上法相同。 这种方法的优点是形成高频率的感受态细胞，可使