丝状真菌少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的分离.ppt

* * 实验七 丝状真菌少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的分离 随着分子生物学研究的发展，目前丝状真菌的分子生物学技术也已建立起来，如：用DNA进行限制性内切酶分析、克隆特定的DNA分子或分离DNA做为杂交探针进行真菌的遗传学研究等。这些研究首先都必须进行分离、提取DNA，核酸在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在的。真核生物的染色体DNA为双链线性分子；原核生物的”染色体“，质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子。95%的真核生物DNA主要存在于细胞核内，其它5%为细胞器DNA，如线粒体DNA、叶绿体DNA等。 本实验将介绍一种简化的制备丝状真菌总DNA的方法，由于制备量少且速度快，因此，该方法制备的DNA适合于作为PCR的模板。 一、实验目的 1. 学习和掌握丝状真菌DNA的提取方法 2．学习聚合酶链式反应的操作技术。 3．从真核微生物少根根霉的总DNA中扩增△6-脂肪酸脱氢酶基因，为△6-脂 肪酸脱氢酶基因克隆提供实验材料。 分离纯化核酸的总原则：之一是保证核酸一级结构的完整性。这是因为遗传信息全部贮存在一级结构之内，同时核酸的一级结构还决定其高级结构的形式及和其它生物大分子结合的方式；原则之二是排除其它分子的污染，如蛋白质、RNA等。 核酸的纯化应达到三点要求：1. 核酸样品中不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；2. 其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染降低到最低程度；3. 排除其它核酸分子的污染，如RNA。 提取纯化应注意的问题： 尽量简化操作步骤，缩短提取时间，减少有害因素对核酸的破坏； 减少化学因素对核酸的降解，为避免过酸，过碱对磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4~10条件下进行； 减少物理因素对核酸的降解，主要是机械剪切力和高温。0~4℃的温度环境降低核酸酶的活性与反应速率，减少对核酸的生物降解； 防止核酸的生物降解，主要是指细胞内、外的各种核酸酶。如DNA酶需要金属二价离子Mg++，Ca++的激活，使用金属二价离子螯合剂EDTA柠檬酸盐，基本可以抑制DNA酶活动。 二、实验原理 核酸的提取步骤：破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质及多糖、脂类等生物大分子，去除其它不需要的核酸分子，沉淀核酸，去除盐类、有机溶剂等杂质，纯化核酸等。 真核细胞的破碎方法有：包括物理、化学和酶解作用裂解细胞，使DNA释放出来。物理法：煮沸、冻融、微波、超声波、匀浆、液氮研磨，Al2O3粉研磨法等，这些物理操作可导致DNA链的断裂。化学法：高盐、表面活性剂SDS、热酚法等。酶解法：裂解酶、溶菌酶、蛋白酶K等，此方法较为温和，可获得大分子量的DNA。 核酸去蛋白：一般程序是酚；酚/氯仿；氯仿抽提，其原理：交替使用酚、氯仿这两种不同的蛋白质变性剂，以增加去除蛋白质的效果。因为酚虽然可有效地变性蛋白质，但它不能完全抑制RNase的活性。氯仿能加速有机相与液相分层。在氯仿中加入少许异戊醇的目的在于减少蛋白质变性操作过程中产生气泡。最后用氯仿抽提是为了去除核酸溶液中的痕量酚。 沉淀核酸：是浓缩核酸最常用的方法。最大优点是通过核酸沉淀来改变核酸的溶解缓冲液及重新调节核酸在溶液中的浓度，可去除溶液中某些盐离子与杂质，在一定程度上纯化核酸。核酸是多聚阴离子的水溶液化合物，它与Na、K、Mg形成的盐在许多种有机溶剂中不溶解，但也不会被有机溶剂变性，常用的有机溶剂有乙醇、异丙醇、聚乙二醇等。 传统法 鳌合树脂法 玻璃粉法 磁珠法 免疫亲和法 DNA 提取 酚/ 氯仿等有 Chelex 100 树脂 玻璃粉吸附 磁珠吸附、磁 抗原抗体反应 机溶剂抽提 场分离 、磁场分离 适用范围 大多数标本 培养及各种 土壤标本 冰冻、陈旧 冰冻、陈旧组织, 样 DNA 提取、纯化 临床标本 组织 本含量很少的标本 方法评价 获得的DNA 纯 简单、快速、且 提取方法简便,