DNA条形码技术在药植物鉴定方面的应用.ppt

DNA条形码技术（2003年,Herbert）是通过对一个标准目的基因的DNA序列进行分析从而进行物种鉴定的技术。这个概念的原理与零售业中对商品进行辨认的商品条形码是一样的。简单地说，DNA条形码技术的关键就是对一个或一些相关基因进行大范围的扫描，进而来鉴定某个未知的物种或者发现新种。 因此，可尝试建立一种DNA条形码系统，即利用标准的、具有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段在物种内的特异性和种间的多样性而创建的一种新的生物身份识别系统,用于多来源药材的鉴定和质量评价。 Paul Hebert等对动物界包括脊椎动物和无脊椎动物共11门13 320个物种的线粒体细胞色素c氧化酶亚基1（Cytochrome coxdase I，CO I）基因序列比较分析,发现98%的物种遗传距离差异在种内为0%-2%，种间平均可达到11.3%，据此提出可以用单一的小片段基因来代表物种。 因此，他们将超市用以区分成千上万种不同商品的条形码概念引入，把这种小片段基因序列称作物种的DNA条形码（DNA barcodes），并提出为全球生物编码的计划。 DNA条形码的原理：DNA是生物的遗传信息载体，遗传物质的不同，决定了生物的多样性。由于每种生物物种的DNA序列都是唯一的，就给DNA条形码提供了物质基础。 由于部分碱基的保守性，几十个碱基的长度不能提供足够的编码信息，因此目前的DNA条形码分析都是基于几百个碱基长度的DNA序列。 (3)准确性高。特定的物种具有特定的DNA序列信息，而形态学鉴别特征会因趋同和变异导致物种的鉴定误差。 (4)通过建立DNA条形码数据库，可一次性快速鉴定大量样本。分类学家新的研究成果将不断地加入数据库，成为永久性资料，从而推动分类学科更加快速深入地发展。 DNA的提取 根据样品的不同，可以采用不同的提取方法，例如CTAB法、Trizol QiagenDNeasykit等 (DoyleJJ， DoyleJL.1987) 设计通用引物 一般情况下，可以通过分析NCBI和GenBank数据库中的DNA序列，在模板的保守区内利用专业软件设计引物。 PCR扩增 以样品DNA为模板，利用通用引物进行扩增。不同序列有不同的PCR程序。有时需要在实验中调整PCR程序，才能得到目标序列。一般而言，如果样品DNA纯度高且完整，则有利于PCR的进行。 如果样品DNA有较为严重的降解现象，可以根据基因叶绿体trnL (UAA)内含子的短片段重新设计通用引物，有利于序列扩增。 琼脂糖凝胶电泳 用于检测PCR扩增效率，选取扩增效果好的样品，进行单向或双向测序。 测序原理 目前用于测序的技术主要是Sanger于1977年发明的双脱氧核糖核酸链末端终止法。 这种测序方法是根据核普酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核普酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。 基本原理是每个反应含有所有四种脱氧核营酸三磷酸 (dNTP)使之扩增，并混入限量的一种不同双脱氧核普三磷酸(ddNTP)使之终止。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3’一OH基团，使延长的寡聚核普酸选择性地在G、A、T或C处终止，终止点由反应中相应的双脱氧而定。 序列分析 生物条形码工程的首要目标是建立可用来作为鉴定标本工具的基因序列数据库。目前只建立了动物条形码数据库，植物条形码尚处于评估阶段，只有该技术在植物中进一步完善后才有可能建立相应的数据库。 序列数据分析是DNA条形码探索的最重要环节，由于植物的种间杂交现象比较普遍，因此植物条形码的分析方法也处于不断的摸索中。 目前报道的序列分析方法基本分为以下几步： (1)序列比对和人工校正。一般采用Clustal W，生命条形码数据库中使用Hidden Markov Models行序列比对，也可以BLAST search在Genbank中有哪些信誉好的足球投注网站相似的基因片段对比片段信息的可靠性。 (2)遗传分析。植物条形码需要对不同片段的种间和种内变异进行对比，以选择最佳的片段或片段组合。种间距离基本采用Kimura-2-parameter distance(K2P)模型计算。理想的DNA条形码检测到的种间遗传变异应明显大于种内遗传变异。 (3)系统学分析。采用标准的系统学分析方法，建立系统发生树，检验同一个物种的不同个体能否聚在一起。 生物条形码联盟(CBOL)最初建议的植物条形码片段均为叶绿体段：matK，rpoC1，rpoB，accD，nhdJ和YCF5。但因为后3个片段在一些主要的植物类群中有缺失，如YCF5在苔藓类植物中缺失，accD在禾本科植物中缺失，而ndhJ在松属植物中缺失，因此它们在