Ⅲ— 硷性磷酸酶的分离纯化及鉴定.docVIP

酶工程实验内容 实验一? 硷性磷酸酶的分离纯化 一、实验目的 1.掌握酶分离纯化的一般步骤及相关原理； 2.悉碱性磷酸酶的分离纯化的方法步骤。 二、实验原理 本实验采用有机溶剂沉淀法从肝匀桨中分离纯化碱性磷酸酶(简称AKP)。先用低浓度醋酸钠(低渗破模作用)制备肝匀浆。醋酸镁则有保护和稳定AKP 的作用。匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。含有AKP 的滤液用冷丙酮和冷乙酸进行重复分离纯化。根据AKP 在33％的丙酮或30％的乙醇中溶解，而在50％的丙酮或60％的乙酸中不溶解的性质，用冷丙酮和冷乙醇重复分离提取，可从含有AKP 的滤液中获得较为纯净的碱性磷酸酶。 三、仪器、原料与试剂 仪器 移液管、量筒、玻璃勺浆器(管)、剪刀、离心机、新华定性滤纸。 原料 新鲜兔肝 试剂 1. 0.5mol/L 醋酸镁溶液：107.25g 醋酸镁溶于蒸馏水中，定容至1000 m1。 2. 0.1mol/L 醋酸钠溶液：8.2g 醋酸钠溶于蒸馏水中，定容至1000 m1 3. 0.0lmol/L 醋酸镁一0.01mol/L 酸酸钠溶液：准确吸取20mL 0.5mol/L 醋酸镁溶液及100mL0.14mol/L 醋酸钠溶液，混匀后定容至1000 m1。 4. Tris—HCl pH8.8缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷12.1g，用蒸馏水溶解后定容至1000mL，即为0.1mol/LTrls 溶液。取100m10.1mol/LTrls 溶液，加蒸馏水约780mL，再加0.1mol/L 醋酸镁溶液100m1，混匀后用1％冰醋酸调pH 为8.8，用蒸馏水定容至l000m1。 5. 正丁醇、丙酮、95％乙醇均为分析纯试剂。 四、实验操作 分离纯化硷性磷酸酶的操作流程如下（以下操作均在0-4进行） ? 将分离提取的硷性磷酸分装成2ml瓶，冰冻干燥保存或液体保存也可，但均置于-60低温冰箱保存。应用时稀释5—7倍测其Km值。 一、原理 当温度、PH及酶浓度恒定的条件下，酶促反应的初速度随作用物浓度[S]增大而增大，但增大到一定限度时，作用物浓度再增加，则反应速度不再增加。此时反应速度为最大速度（Vmax）。Michaelis Menten对酶促反应速度与作用物浓度之间的这种关系进行了大量实验研究，并于1913年提出了数学方程式，即著名的米一曼方程式： 式中Km即为米氏常数，Vmax为最大反应速度，当V=Vmax/2时，则Km=[S]。 作图后，将各点连线延长，直线与横轴的交点为 ???，根据在横轴上的截距，可以计算出该酶的Km。 本实验以硷性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，硷性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷酸，酚在硷性溶液中与4氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色的醌衍生物，根据红色深浅可测出酶活力高低。其反应式如下： 利用在不同作用物浓度的条件下，测定的酶活性（A），按Lieweaver-Burk二氏法作图，从?x?轴上的截距求得其Km值。 ?二、实验准备 ?（一）仪器 ?1.恒温水浴 2.滴定管 3.有塞锥瓶 4.721型分光光度计 （二）试剂 2. 0.1mol碳酸盐缓冲液（pH10.0）： 称取无水碳酸钠6.36g及碳酸氢钠3.36g，溶解于蒸馏水中，并稀释至1,000ml. 3. 硷性磷酸酶液：? 取纯化的硷性磷酸酶5mg，用pH10缓冲液配制成100ml，放置冰箱内保存。或用自己提取的硷性磷酸酶液，用pH10缓冲液稀释至5—7倍。 4. 0.5mol/L NaOH溶液 5. 0.3%4氨基安替比林：? 称取3g4氨基安替比林及碳酸氢钠42g，用蒸馏水溶解，并稀释至1,000ml，贮于棕色瓶中，放冰箱内保存。 6. 0.5%铁氰化钾：? 称取10g铁氰化钾及30g硼酸各溶于800ml蒸馏水中，溶解后两液混合加水至2,000ml。置棕色瓶中，放冰箱内保存。 三、操作 加入酶液，混匀之后立即计时，各管在37水浴中准确保温15分钟后，立即加入0.5Mol NaOH液1.0ml以终止反应。2. 显色 各管中加入0.3%4氨基安替比林1.0ml和0.5%铁氰化钾2.0ml，充分混匀，放置10分钟，以0管为对照，在波长510nm下比色，记录各管的吸光度。3. 作图 所策测各管的吸光度代表各管中反应速度V，以之为纵轴，以作用物浓度[S]为横轴，在坐标纸上连接各点作图，观察曲线的形状。以各管吸光度值的倒数 为纵坐标，以作用物浓度的倒数 为横坐标，作图并求此酶的Km值。 采用兔肝提取碱性磷酸酶来测定其Km时，一般可稀释2-3倍，由于各实验室所用试剂等各种条件差异，酶活性可能有不同，所以在实验前应作调节，按本实验条件，用最高的作用物浓度管做实验，所得到的吸光度应调节在0.8以下，如酶活性过大，在规