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RT-PCR三部曲 RNA提取-第一步 提取RNA器械的处理 玻璃、不锈钢器皿：180度干烤4~6小时 （不离人） 塑料制品： -高压灭菌，烘干 -DEPC水浸泡过夜，捞出沥干水分（很重要），烘干 -电泳槽可用0.5M的NaOH浸泡20min RNA提取所需试剂和器皿清单 干烤的物品： 玻璃器皿：1000~2000ml的大烧杯（浸泡Tip）、100ml的量筒（配乙醇用）、带玻璃塞子的玻璃瓶3个（装异丙醇、氯仿、75%的乙醇） 铝饭盒（放ET管）、镊子（夹Tip和EP管用） 处理的塑料制品： 枪头（1000ul/200ul/20ul） EP管（1.5ml、200ul） EP管盒子（要与枪头配套） 制剂： DEPC、Trizol 异丙醇、氯仿、乙醇(未开封的) 电泳缓冲液、琼脂糖、EB DEPC（焦碳酸二乙酯） DEPC水， A：配制好未消毒；蒸馏水中加入0.1%DEPC，室温搅拌4小时以上至完全溶解。 作用：处理RNA提取的器材（不能干烤的物品） 浸泡过夜 B:配制好已消毒。高压灭菌20分钟，冷却备用。（通过高压消毒，该物质会降解，从而无毒） 作用:配置75%乙醇，溶解RNA 防止RNA降解 有专门的RNA提取区域：避免人员流动 实验人员带口罩、帽子，勤换手套 快速操作 保证低温环境：降低环境温度、冰上操作（冰盒）、低温离心 1 Rnase是一种蛋白酶，能够降解RNA。2 皮肤、唾液3 这个酶高效稳定。要么在DEPC水中处理n小时，要么在160度高温烘烤6小时。此酶才会失效。 1 1mlTrizol/孔，室温放置5min，用吸管吹打吸取到EP管中；2 加200ul氯仿 剧烈振荡15s，室温放置2－3min；3 12000g 低温离心 15min;4 小心取上层水相,一般400-450ul就足够了（千万不要贪多）！ 5 加入500ul异丙醇 摇匀（反复颠倒10次），室温放置10min； 6 12000g 低温离心 10min；7 75％乙醇 1ml 洗涤沉淀；8 7500g 离心 5min；（也可加大离心速度，这样RNA不易被倒掉）9 小心弃去乙醇（不要把RNA倒掉），用小Tip吸干净残余的乙醇（底部不要吸的太干， 室温干燥5－10min； 10 加20~30ul DEPC水溶解沉淀。 留取6ul，其余立即分装两份冻存（-80度） 2ul用于定量，余下用于跑胶 电泳---判断RNA完整性和是否有DNA污染 新鲜配置的电泳缓冲液 电泳时间不要太久，100~120V，10－15min足够了。 如何判断RNA的完整性： 最理想的RNA 定量 1：70（1ul+69ul的水） * * RNA提取 逆转录为cDNA PCR 什么是RNA酶Rnase? 降解的RNA是酱紫滴 * * * 降解的RNA是酱紫滴，条带间界限模糊，有拖尾，不过右边的降解还可容忍，可继续做下一步实验。为避免时间的延长导致降解的加重，宜立即逆转录，变成cDNA就安全了 降解的RNA是酱紫滴，条带间界限模糊，有拖尾，不过右边的降解还可容忍，可继续做下一步实验。为避免时间的延长导致降解的加重，宜立即逆转录，变成cDNA就安全了